上皮细胞间质转化与肺纤维化的研究进展

曾仁凤 何振华 张秀峰

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）通常是慢性肺疾病最终的表现结果，是全球肺疾病发病率及死亡率的重要原因之一。肺纤维化是以多种原因引起的上皮细胞受损，修复障碍，上皮细胞活化、损伤，导致大量细胞因子释放、细胞外基质沉积、异常间质细胞活化和增生为特征的疾病。其病理特点主要为大量间质细胞（成纤维细胞、肌成纤维细胞）积聚及增殖，而这些间质细胞来源尚不清楚。最近研究报道，这些细胞是通过上皮细胞间质转化（epithlial to mesenchymal transition，EMT）而来的[1]。

1 EMT

EMT是细胞塑形的一种过程，上皮细胞失去极性，上皮细胞标志物丢失或下调，细胞骨架重建，细胞变成纺锤体形态，获得间质细胞标记物，并且细胞的黏附能力减弱、增殖和迁移能力增强。

2 EMT的主要表型标志物

EMT发生时，上皮细胞标志物丢失，并获得间质细胞标志物，代表上皮细胞的标志物主要有E-钙粘素(E-cadherin，E-cad)，紧密连接蛋白 1（zonula occludens-1，ZO-1)；代表间质细胞的标志物主要有α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、I型胶原蛋白（col type I）、纤维连接蛋白（fibronectin）、纤维状肌动蛋白（F-actin）。下面介绍3种肺纤维化中EMT的主要表型标志物。

2.1 E-cadherin E-cadherin，是典型的EMT上皮细胞标志物[2]。E-cad，分子量大小为120 KDa，广泛分布于胚胎和成熟组织上皮细胞中，位于同种上皮细胞侧面的中间连接处，是一类介导细胞之间互相黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，参与介导上皮型细胞—细胞间的黏附、胚胎发育以及正常组织中上皮细胞层的形成和维持，是细胞连接的重要分子。人类E-cad基因位于16 q 22.1 附近，由723～748个氨基酸组成，包括N端胞外区、高度疏水的跨膜区及C端胞内区。N端是Ca2+的结合位点，对Ca2+有高度敏感性，通过与Ca2+特异性结合而发挥黏附功能；胞内区通过连环素（catenin）与微丝、中间丝、肌动蛋白相连接，形成复合体，使E-cad被锚定于细胞骨架上，与相邻细胞形成稳定连接[3]。当组织受到损伤时，在修复过程中，上皮细胞间E-cad连环素复合物及其核心骨架蛋白发生酪氨酸磷酸化，破坏了该复合体结构的完整性，使得E-cad不能准确定位于膜上，胞浆内蛋白酶将其降解进入胞浆，丧失其黏附的能力，增加了上皮细胞增殖和迁移能力，从而促进上皮细胞的再生修复。

2.2 a-SMA a-SMA是一种间质细胞标志物，由血管平滑肌机细胞及肌上皮细胞表达。a-SMA是一种中等大小的蛋白质，由375个氨基酸组成，分子量为43 KDa。a-SMA被认为是肌成纤维细胞的一种标志物，而这些肌成纤维细胞来自于上皮细胞间质转化，并且与肺纤维化有关[4]，a-SMA的表达与肺纤维化的进展是成正相关的。

2.3 Vimentin Vimentin是常见的EMT间质细胞标记物，来源于成纤维细胞、内皮细胞和白细胞等中胚层细胞。Vimentin是中间纤维家族中的一员，构成间质细胞中最主要的中间纤维，其重要功能是与微管、微丝共同形成一个细胞支架网络而维持细胞完整性。人的vimentin基因位于人类染色体10 p 13上，相对分子量大小约为57 KDa，总共编码466个氨基酸。Vimentin由头部的氨基端（N端）、尾部的羧基端（C端）和两端之间的螺旋杆状区3部分构成，不仅参与肿瘤分化、转移和增殖有着密切的关系，还在细胞的黏附、迁移、增殖、凋亡等生理功能中起重要作用。在炎症的修复过程中，多种细胞因子的参与下，上皮细胞间质转化发生时，波形蛋白的表达上调[5]。

3 EMT促进了肺纤维化

EMT是目前肺纤维化发病机制的研究热点，在肺纤维化的形成中扮演了非常重要的角色。EMT是肺纤维化重要的病理过程[1,6]。EMT是上皮细胞失去极性，上皮细胞标志物丢失或下调，细胞骨架进行重建，细胞变成纺锤体形态，并获得间质细胞标记物的过程[7]。EMT分为3型，Ⅰ型EMT参与胚胎发育、器官形成，Ⅱ型EMT在肺纤维化中发挥作用，Ⅲ型EMT与肿瘤形成、进展有关[8]。很多研究证明EMT与肺纤维化有着密切的关系[5-6,9]。博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，AECs）及气道上皮细胞（bronchial epithelial cells，BECs）发生了上皮细胞间充质转化[6]，实验结果是上皮细胞标志物E-cad的表达下降，而间质细胞标志物a-SMA、F-actin的表达增加。在C^amara[9]的研究中，人的气道上皮细胞（human bronchial epithelial cells，HBECs)）也发生了上皮细胞间质转化，导致E-cad的丢失，获得vimentin、a-SMA。同样，Milara等[5]的研究，无论是在体外实验的A 549细胞中，还是在体内实验的特发性肺纤维化患者中，都证明了上皮细胞间充质转化,伴随上皮细胞标志物ZO-1、E-cadherin的下调，间质细胞标志物α-SMA、vimentin、col type I的上调。这些研究表明EMT的发生促进了肺纤维化的形成。

4 EMT促进肺纤维化的信号通路

4.1 TGF-β/smad通路 转化生长因子β（TGF-β）是一种多功能的细胞因子，通过影响细胞的增生、分化、凋亡、细胞外基质生成来调节组织的形态发生及分化，被誉为是诱导纵多组织（包括肺组织）纤维化的总开关。在正常的哺乳动物上皮细胞中，TGF-β是肺纤维化中上皮细胞间质转化的主要诱导者，包括肾小管上皮细胞、角膜上皮细胞和肺泡上皮细胞[7]。在Kasai等[10]的研究中，使用TGF-β处理的A 549细胞，相差显微镜检查发现肺泡上皮细胞发生了形态学的改变，并且检测到成纤维细胞表型标志物vimentin的表达上升，上皮细胞标志物E-cad表达下调，同时致纤维化因子Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白及结缔组织生长因子（CTGF）的表达升高。这个研究证明了TGF-β能够诱导肺泡上皮细胞发生EMT，而且此项研究还证明了TGF-β诱导EMT是通过活化了的Smad 2。另外，还有研究证明Smad 3也参与了EMT[7]。

TGF-β/Smad信号通路是参与肺纤维化EMT的重要转导途径。Smad是肺纤维化EMT信号通路中TGF-β的下游底物。TGF-β家族细胞受体是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，TGF-β与其胞膜上的受体结合磷酸化进入胞浆，将信号传递给胞浆内的Smad 2与Smad 3，磷酸化的Smad 2与Smad 3再与Smad4结合形成复合体，激活胞核内的核转录因子，从而启动一系列的反应，促进纤维化的形成。

核转录因子包括Snail家族、ZEB家族和helix-loophelix(HLH)家族[11]。Snail属锌指转录因子，其成员包括Snail 1、Snail 2（又称Slug）和Snail 3。在肺纤维化中，主要是Snail1 参与，Smad与Snail1启动子结合，然后进行转录，Snail1通过识别E-cad，并且与E-cad启动子部位的E-box结合，从而抑制E-cad的表达。在Kim等[12]的研究中，TGF-β介导的A 549细胞不尽发生了EMT，还发现Snail1的高表达导致E-cad的丢失。这就表明Snail1与EMT有着密切关系。ZEB包括ZEB1和ZEB 2，ZEB蛋白诱导及调节下游的E-cad，使其表达减少，并且促进细胞的迁移。HLH包括蛋白E 12、E 47、Twist、Id等，也参与了EMT。

4.2 非Smad通路 TGF-β介导的EMT的途径纵多，主要是依赖Smad的信号通路，也是当前研究最热门的信号转导途径，还有其他非Smad的信号通路，包括RhoA/Rock、MAPK、PI3 K/AKt、Wnt等信号通路。

4.2.1 RhoA/Rock 在貂的肺上皮细胞和小鼠乳腺上皮细胞中，小G蛋白RhoA及其下游的Rock被证明参与了TGF-β介导的EMT，对EMT过程中细胞骨架的重排扮演了非常重要的角色[13]。

4.2.2 MAPK TGF-β可以激活MAPK，激活的MAPK影响细胞的紧密连接，细胞骨架重排，促进细胞的迁移，导致上皮细胞向间质细胞转变[11]。

4.2.3 PI3 K/AKt TGF-β通过酪氨酸激酶受体快速激活PI3激酶，是通过Akt激酶活化mTOR/S6激酶1，导致蛋白的合成增加及细胞的增生，参与EMT，抑制间质细胞表型标志物E-cad的表达下降[3]。

4.2.4 Wnt Wnt蛋白本身不能诱导EMT，典型的Wnt信号通路是被β-catenin调节的。β-catenin是细胞紧密连接的一部分，连接细胞骨架间的E-cad。如果Wnt信号被活化，将抑制GSK-3 β，导致胞质中的β-catenin大量累积[11]。激活Wnt信号，抑制GSK-3 β，可以下调E-cad的表达，从而调节EMT[14]。

5 结论

肺纤维化呈进行性发展，是呼吸系统最严重慢性疾病之一，最终导致呼吸衰竭而亡。目前肺纤维发病机制尚不清楚，缺乏有效的治疗手段。TGF-β介导的EMT在肺纤维化形成机制中扮演了非常重要的角色，因此加强对EMT的科学研究，为肺纤维化的治疗提供新靶点。

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