李文桔,王乐丹,吕杰强
(温州医科大学附属第二医院 妇科,浙江 温州 325027)
·论 著·
噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞表面转移相关分子结合肽
李文桔,王乐丹,吕杰强
(温州医科大学附属第二医院 妇科,浙江 温州 325027)
目的:利用噬菌体7肽库筛选高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM表面转移相关分子结合肽。方法:利用噬菌体展示技术体外快速差减筛选(biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands,BRASIL)卵巢癌细胞株HO-8910和HO-8910PM,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选14个噬菌体单克隆进行DNA测序,并进行ELISA、噬菌体竞争结合实验验证阳性噬菌体的亲和性。结果:噬菌体克隆Z3(短肽LRLRNTR)对高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM有较高的亲和性。结论:噬菌体展示技术筛选的短肽LRLRNTR可望为卵巢肿瘤早期诊断、转移复发及治疗提供新的方向。
卵巢肿瘤;噬菌体展示技术;噬菌体多肽库;多肽
卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌、子宫体癌,是妇科致死率最高的恶性肿瘤[1]。因其发病隐匿,易扩散转移,致使50%~80%停止治疗的卵巢癌患者出现转移复发,因此5年生存率始终徘徊在25%~30%[2]。虽然CA125已被广泛用于诊断卵巢癌及监测卵巢癌治疗后的复发[3-4]。但CA125的特异性不强,尽管大于80%的晚期上皮性卵巢癌患者CA125升高,但在其他生理或病理情况下CA125也会有升高[5]。因此寻找特异性更强、灵敏度更高的与肿瘤侵袭转移相关的分子标记物用于卵巢癌的早期诊断、转移复发及治疗显得尤为重要。
1985 年Smith[6]创立了噬菌体展示技术,经过多年的发展和完善,噬菌体展示技术在肿瘤抗原筛选、单克隆抗体、药物研制等[7-10]方面发挥重要作用,这为研究肿瘤的发生发展、诊断及治疗提供了新的方向。
本研究主要以低转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910为吸附细胞,高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM为靶细胞,利用噬菌体7肽库进行体外快速差减筛选,从而获得卵巢癌细胞株HO-8910PM细胞表面转移相关分子结合肽。
1.1 材料
1.1.1 随机肽库及主要试剂:噬菌体随机7肽库(Ph.D-7TM phage display peptide library)购自美国New England Biolabs公司,文库滴度为2×1013pfu/mL,随机多样性为1.28×109,受体菌E.coli ER2738,-96 g I I I sequencing primer(5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’),HRP-抗M13单抗(GE Healthcare.#27-9420-01)。
1.1.2 细胞来源:卵巢癌细胞株HO-8910和HO-8910PM购自上海拜力生物科技有限公司,卵巢癌细胞株SKOV3和胰腺癌细胞株PANC-1购自上海中科院。
1.2 方法
1.2.1 差减筛选:消化、收集细胞HO-8910和HO-8910PM,重悬于含1% BSA的DMEM无血清培养液,调整细胞数为1×107/mL;取100μL HO-8910细胞,与噬菌体随机7肽库10μL孵育2 h(4 ℃,30 r/ min);将细胞和噬菌体的混悬液加在200μL邻苯二甲酸二丁酯与环己烷组成的有机分离液上(200μ L、体积比为9:1,密度为1.03 g/mL),10 000 g、4℃离心10 min;取出水相里未结合的噬菌体与100 μL HO-8910PM细胞孵育3 h后离心;取出有机相内的沉淀物,转移至200μ L对数生长期的大肠杆菌ER2738,37 ℃孵育30 min复苏与HO-8910PM细胞结合的噬菌体,测滴度、扩增、纯化,再进入下一轮差减筛选,如此重复5个循环,测定每一轮淘洗后和扩增后的滴度,计算回收率(洗脱后的噬菌体滴度/淘洗加入噬菌体滴度)。
1.2.2 DNA测序和BLAST匹配:取第5轮生物淘洗后噬菌体铺制的IPTG/X-gal平板,随机挑选14个蓝斑进行扩增,提取噬菌体DNA,由上海生工公司进行测序分析,通过DNA测序结果推导出多肽序列。通过网络数据库进行BLAST匹配分析。
1.2.3 噬菌体竞争结合实验:分别扩增、纯化经差减筛选所得到的7种噬菌体,测定扩增后的噬菌体滴度,以M13K07为对照噬菌体,测定这7种噬菌体与HO-8910PM的相对结合效率。如前所述配制HO-8910PM细胞悬液,分别将待检测的噬菌体与M13K07噬菌体按1:1混合分别与100μ L的HO-8910PM细胞孵育2 h(4 ℃,30 r/min);离心、复苏、测滴度。由于M13K07噬菌体不含lac-Z基因,故在IPTG/ X-gal平板上显示白斑,分别计数蓝斑和白斑数目,按照下面的公式计算待测噬菌体与HO-8910PM细胞的相对结合效率(产出待测噬菌体数目/产出M13K07噬菌体数目)。
1.2.4 ELISA:将细胞株(HO-8910PM,SKOV3,PANC-1)以104/孔接种入96孔板;无血清培养1 h;4%多聚甲醛固定20 min;封闭液(PBS加1% W/V BSA)封闭1 h(每孔200μ L);分别加入筛选的噬菌体克隆(1010pfu/孔),阴性对照,PBS和M13K07,37℃孵育2 h(用封闭液稀释,预先室温孵育15~30 min,除去非特异性结合);加入HRP-抗M13单抗以1:6 000稀释于封闭液中(200μL/孔)室温孵育2 h;最后加入200μ L/孔TMB显色液,室温孵育20~60 min显色,使用微板阅读器设置在410 nm。
2.1 差减筛选为了筛选卵巢癌细胞转移相关分子结合肽,本实验以HO-8910为吸附细胞,以HO-8910PM为靶细胞,利用噬菌体7肽库进行差减筛选,计算每一轮的回收率,经过5轮差减筛选,回收率从2.0×10-5增加至4.3×10-5(见表1)。
表1 噬菌体7肽库差减筛选HO-8910PM转移相关分子结合肽
2.2 DNA序列测定随机挑选14个噬菌体单克隆进行DNA序列测定,结果显示14个噬菌体克隆包含7种氨基酸序列,其中展示Leu-Arg-Leu-Arg-Asn-Thr-Arg(LRLRNTR)序列的噬菌体被富集(见表2)。
表2 噬菌体克隆序列分析及与HO-8910PM细胞的相对结合效率(±s)
表2 噬菌体克隆序列分析及与HO-8910PM细胞的相对结合效率(±s)
出现频率噬菌体编号Z1/7/8 Z3/4/6/11/14 Z2 Z5 Z9 Z10 Z13多肽编号ZP2 ZP1 ZP3 ZP4 ZP5 ZP6 ZP7氨基酸序列MRMTIIN LRLRNTR KIIRNTR PIKTNRK LNRMLQI IKRSKKM NPMIRRQ 3 5 2 1 1 1 1相对结合效率51.7±1.53 69.0±2.65 22.7±2.52 16.3±1.15 14.7±1.53 10.7±0.58 18.3±2.08
2.3 噬菌体竞争结合实验以M13K07为内参照,测定筛选出的7种噬菌体与HO-8910PM的结合效率。结果显示所获得的噬菌体与HO-8910PM细胞表面的相对结合效率明显高于对照噬菌体(10.7~69.0倍;平均39.8倍),其中噬菌体Z3与HO-8910PM细胞表面的结合效率是对照噬菌体的69.0倍(见表2)。
2.4 ELISA在ELISA实验中,OD随机克隆/OD阴性对照克隆(P/N)>2.1时,即表示细胞与此克隆具有高亲和力,而本实验中噬菌体Z1、Z3的P/N>2.1,且Z3噬菌体的P/N>7。见图1。
图1 ELISA鉴定不同噬菌体克隆与三种肿瘤细胞的亲和力
噬菌体展示技术最大的优势即实现了基因型和表型的结合,因而不需要预先知道任何肽类结构的信息,通过对亲和筛选获得的阳性克隆的基因进行序列测定,就可间接推导出所递呈的外源多肽的氨基酸序列。近年来以噬菌体展示技术为手段开展抗肿瘤短肽的研究,己经取得了一些进展。Zhang等[11]用结肠癌细胞SW480和人正常的肠上皮细胞对噬菌体7肽库进行多轮筛选,结果显示CP15(VHLGYAT)与结肠癌细胞SW480结合率最高,而与正常的肠上皮细胞几乎不结合,为诊断结肠癌和开发治疗结肠癌药物奠定了基础。目前国内外针对抗卵巢癌短肽的研究只有少数报道。Zhang等[12]利用噬菌体随机12肽库筛选与卵巢癌细胞SK-OV-3特异性结合的小分子多肽,得到短肽ZP1(SVSVGMKPSPRP),初步认为是卵巢癌靶向治疗和靶向诊断的一种配体肽段。
本研究亦采用噬菌体展示技术,但在此基础上联合应用体外快速差减筛选技术,能有效减少非特异性结合,提高筛选效率。经过5轮差减筛选,回收率从2.0×10-5增加至4.3×10-5。虽然高于10倍的富集度才是理想的,但高于两倍常常就是显著的,从DNA测序结果分析来看也证明存在噬菌体的富集。为进一步筛选所获得的7种阳性噬菌体,我们采用噬菌体竞争结合实验,以M13K07为内参照来研究阳性噬菌体与HO-8910PM细胞表面的结合效率,其可明显克服众多因素的影响,如加入噬菌体的数目,细胞数量,竞争结合实验过程中离心、复苏、测滴度等,因而可获得较好的重复性。随后利用ELISA鉴定HO-8910PM与噬菌体单克隆亲和力,结果显示Z1、Z3的P/N>2.1,且Z3噬菌体的P/N>7,而同种噬菌体不同肿瘤细胞之间的OD值之比<2.1,由于肿瘤细胞均有转移侵袭的特性,但不同肿瘤细胞转移侵袭能力不同,故可以推测噬菌体Z3与这三种肿瘤细胞均有较高亲和力,尤其对高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM有较高亲和力。
综上所述,本研究以遗传背景相同,转移潜能不同的卵巢癌细胞株差减筛选出的噬菌体Z3,其表面展示的短肽LRLRNTR可能与卵巢癌转移侵袭有关,可望能为卵巢癌的早期诊断、转移复发及治疗提供新的方向。未来我们还可以进一步鉴定高转移卵巢癌细胞表面转移相关分子结合肽的生物学功能,根据此多肽序列人工合成抗肿瘤药物或者化学检测药物,进行动物体内的噬菌体展示实验等。
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(本文编辑:吴健敏)
Screening metastasis related peptides binding to the surface of ovarian tumor cells by phage display
LI Wenju, WANG Ledan, LV Jieqiang.Department of Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027
Objective: Using 7-mer phage display peptide library in vitro to isolate metastasis related peptides on the surface of the high metastatic potential ovarian tumor cell line HO-8910PM.Methods:Phage display technology with biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands between cell lines HO-8910 and HO-8910PM was utilized. After five rounds of biopanning, 14 phage clones were randomly selected for sequencing of DNA. Using ELISA and phage competitive binding experiment the affinity of positive phages combined with HO-8910PM cells was identified.Results:The phage clone named Z3 (peptide LRLRNTR) showed higher affinity to HO-8910PM cells.Conclusion:The peptide LRLRNTR screened by phage display technology may offer a new direction for early diagnosis, metastasis and treatment of ovarian tumor.
ovarian tumor; phage display technology; phage peptide library; peptides
R711.75
A
1000-2138(2014)02-0127-04
2013-10-15
李文桔(1988-),女,浙江温州人,硕士生。
吕杰强,教授,Email:jieqianglu@126.com。