石油脱硫菌的筛选与培养基优化*

张 虹 汪 洋 袁红梅 尤凤丽 黄永红

大庆师范学院

石油脱硫菌的筛选与培养基优化*

张 虹 汪 洋 袁红梅 尤凤丽 黄永红

大庆师范学院

生物脱硫（BDS）技术具有选择性高、反应条件温和、设备投资和操作费用低等优点，是实现燃料油深度脱硫最有效的技术之一。实验分离得到6株可降解DBT的脱硫菌，经比较确定了B5为高效脱硫菌株，需进一步进行菌种鉴定。对B5菌株的脱硫条件进行优化，确定脱硫最佳培养基是葡萄糖作碳源、牛肉膏作氮源，最佳接种量为8%，最佳DBT的含量为20mg/L，最佳pH值10、温度30℃，最佳菌龄3天，装液量在最少的时候脱硫效果最好。

脱硫菌；菌株；培养基；优化；接种量；脱硫效果

传统的物理和化学脱硫方法（HDS）存在着脱硫不完全、成本高和操作费用高等缺点[1-2]。相比之下生物脱硫（BDS）技术具有选择性高、反应条件温和、设备投资和操作费用低等优点，是实现燃料油深度脱硫最有效的技术之一[3]。在脱硫微生物筛选过程中，DBT是公认的脱有机硫模式化合物，据此分离出来的菌种可有效脱出有机硫，且不破坏C—C结构，从而保留了燃料的热值[4]

1 材料与方法

1.1 实验材料

样本材料取自大庆炼化公司聚合物二厂未被排除的工业废水。实验器材包括压力蒸汽灭菌锅（TOMY ES—315），721型紫外分光光度计，振荡培养箱（HZQ—F160），超净工作台（VS—1300L—U），离心机（Allegra64R）。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的富集与分离

取10 mL水样加到90 mL的NB培养基中，30℃，200 r/min培养3 d后，从中取2.5mL的上清液加到50mLBSM培养基的三角瓶中，相同培养条件培养后，将菌液制备成梯度稀释液（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍），逐一标记，分别取0.1mL稀释液加到BSM固体平板上，28～30℃恒温培养2～3 d至菌落出现。

挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到单菌株的纯培养物，纯化菌株保存于LB斜面培养基上，4℃冰箱保存。

1.2.2 菌株降解效果的测定

挑取单菌落接入装有5mLNB培养液的试管内，30℃，150 r/min摇床培养24 h作为种子液。取lmL种子液接入装有50mLBSM2培养基的250mL三角瓶中，30℃，250 r/min摇床培养72 h，用10%的Na2C03溶液将菌种发酵液调pH值为8.0，5 000 r/min离心10min除菌体，取上清4mL，加入Gibb’s试剂40μL，混匀，30℃反应30min后，测其在610 nm处吸光度，代入回归方程测出2 HBP含量。

1.2.3 脱硫菌脱硫条件的优化

（1）培养基的优化。以BSM培养基为基础培养基，分别取5 g/L葡萄糖、2.5 g/L蔗糖、6 mL/L乙醇、8mL/L甘油、4 g/L乙酸钠和1.2 g/L柠檬酸钠作为碳源，72 h培养后用紫外分光光度计测定并计算2—HBP含量，确定最适宜的碳源。以最佳碳源作为BSM碳源，分别取2.5 g/L NH4Cl、2 g/L NH4O3、5 g/L KNO3、10 g/L牛肉膏和25 g/L蛋白胨作为氮源，72 h培养后测定菌体产生2—HBP量，确定最适宜的氮源。

（2）培养条件的优化。培养基选取最佳碳源和氮源，以DBT为唯一硫源，以2%、4%、6%、8%、10%的接种量培养72 h。通过测定菌体产生的2—HBP量确定最佳接种量。在最佳碳源、氮源和接种量的培养基中添加浓度为20、40、60、80和100mg/L的DBT，培养72 h确定最佳的DBT浓度。最佳培养基中设置6、7、8、9、10不同pH值，培养72 h确定最佳的pH值。设置20、25、30、35、40℃不同温度，培养72 h确定最佳温度。选取冰箱保存的菌株活化培养2、3、4、5天，将不同菌龄的菌分别接种于最佳培养基，培养72h确定最佳菌龄。设置不同装液量，即每个250mL三角瓶分别装液体培养基40、50、60和70mL，培养72 h，研究通气量状况对菌体脱硫影响。

2 结果与分析

2.1 脱硫菌的富集与分离

对炼化公司聚合物二厂工业废水进行系列稀释与划线分离，在BSM平板上得到优势菌6株，分别为B1～B6。菌落形态见表1。

表1 菌落形态特征

2.2 菌株降解效果的测定

筛选得到的6株菌在以DBT为唯一硫源的BSM2培养基中发酵培养，产物与Gibb’s试剂在碱性环境中均可生成蓝色复合物[5]，证明产物含2—HBP。利用分光光度计测出这几种菌在610 nm处的吸光度，代入回归方程计算生成2—HBP量，以判定菌体脱硫能力的高低。通过不同菌株的降解效果对比可知，菌株B5的2—HBP浓度最高，说明B5脱硫效果最好。

2.3 脱硫菌培养条件的优化

2.3.1 培养基的优化

碳源分别是葡萄糖、蔗糖、乙醇、乙酸钠、甘油和柠檬酸钠时B5的脱硫情况表明，该菌在几种碳源作用下均可脱硫，但葡萄糖作碳源时，菌体脱硫效果最好，最高可产生7.97 mg/L的2—HBP。

从不同氮源对菌B5脱硫效果可看出，菌体在牛肉膏作氮源时最高可产生1.56mg/L的2—HBP。

2.3.2 培养条件的优化

从不同接种量对菌B5脱硫效果的影响可以看出，接种量小，脱硫效果不好；随着接种量的增高，脱硫效果有所提高，但接种量达8%以后，随着接种量的增加，脱硫效果反而有所下降。接种量大容易造成杂菌污染[6]，因此最佳接种量为8%，可产生2.23mg/L的2—HBP。

从不同DBT浓度对菌B5脱硫效果的影响可见，浓度为20mg/L时，B5最高可产生0.973mg/L的2—HBP，显示这时脱硫效果最好；随着DBT浓度的增高，脱硫有所减弱，在80mg/LDBT浓度以后脱硫效果随着DBT浓度的增加大幅下降，分析可能与脱硫底物抑制物有关。

从不同pH值对菌B5脱硫效果的影响可见，脱硫效果在pH值为8时最好，可生成3.164 12mg/L的2—HBP。

从不同温度（20、25、30、35、40℃）对菌株B5脱硫影响可见，温度太高或太低都不利于菌的脱硫效果；在30℃时，2—HBP产生量可达最大值，为4.569mg/L。

从不同菌龄的菌株（2、3、4、5天）对B5脱硫效果的影响可见，活化3天以后的菌株脱硫效果最好，可产生5.47mg/L的2—HBP。

装液量的大小主要影响培养过程中的通气及溶氧情况，从不同装液量（40、50、60、70mL）对菌株B5脱硫效果的影响可见，菌株的脱硫效果随着装液量的增多而减弱，这与好氧菌培养特点一致。

根据以上优化实验结果，配置以葡萄糖为碳源、牛肉膏为氮源的培养基，选择3天菌龄的菌株，按8%比例接种，装液量40 mL，在pH值为8、温度30℃的培养条件下研究脱硫状况。实验发现，B5菌株在前两天脱硫效果不好；从第4天起，脱硫效果明显增强，最高可产生13.12mg/L的2—HBP；但一周以后脱硫效果没有明显上升，结果与优化预期结果一致。

3 结论

（1）实验分离得到6株可降解DBT的脱硫菌，经比较确定了B5为高效脱硫菌株，需进一步进行菌种鉴定。

（2）对B5菌株的脱硫条件进行优化，确定脱硫最佳培养基是葡萄糖作碳源、牛肉膏作氮源，最佳接种量为8%，最佳DBT的含量为20mg/L，最佳pH值10、温度30℃，最佳菌龄3天，装液量在最少的时候脱硫效果最好。

[1]田晓娟，唐凌天，彭立娥，等．石油脱硫微生物菌株的筛选及鉴定的研究[J]．地学前缘，2008，15（6）：192-198.

[2]杜长海，马智，贺岩峰，等．生物催化石油脱硫技术进展[J]．化工进展，2002，21（8）：569-571.

[3]马艳，刘成，邹少兰，等．石油微生物脱硫的研究进展[J]．工业微生物，2007，37（2）：57-63.

[4]杨宇，刁梦雪，师舞阳．油田土壤中脱除有机硫菌株的分离与鉴定[J]．生态环境，2006，15（5）：1 009-1 013.

[5]张娟，李清雪，陈春燕．高效脱硫菌的筛选及脱硫性能研究[J]．河北建筑科技学院学报，2006，23（1）：5-7.

[6]侯影飞，孔瑛，杨金荣，等．石油生物脱硫菌UP—1培养及反应条件的优化[J]．2005，29（1）：111-115.

（栏目主持杨军）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.6.003

基金论文：黑龙江省教育厅自然基金项目“大庆油田石油脱硫微生物激励研究”（11523001）。