ABCA1 R219K基因多态性与脑梗死合并2型糖尿病的关系

陈卫蓉 肖志杰 周中华 邓 可

动脉粥样硬化性血栓性脑梗死是脑梗死中最常见的类型，其基本病因为动脉粥样硬化。多个研究表明ABCA1 R219K的KK纯合子是冠状动脉粥样硬化的独立保护因素［1～3］。本研究采用病例－对照方法，拟探讨ABCA1基因多态性是否能够通过影响组织脂质转运而与2型糖尿病的发生相关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象 脑梗死组来源于2001年2月～2002年11月在湘雅二医院神经内科住院的脑卒中患者，共279例，其中男162例，女117例，年龄30～90岁，平均年龄（62.5±11.4）岁，体重指数（BMI）（23.94±3.46）。所有脑梗死患者均符合全国第四届脑血管病会议修订的诊断标准，并经头颅CT／MRI检查证实。其中伴有高血压病176例，糖尿病56例，有脑卒中家族史56例，吸烟史140例，饮酒史86例。对照组351例为长沙市雨花区普查和同期门诊体检的非心脑血管疾病人群，其中男201例，女150例，年龄40～82岁，平均年龄（61.6±7.0）岁，BMI（23.34±3.47）。其中伴有高血压病112例，糖尿病21例，有脑卒中家族史14例，吸烟史144例，饮酒史84例。凡下列情况者予以剔除：伴随脑出血、结核或明显肺部感染、恶性肿瘤、严重肝肾功能不全者。脑梗死组和对照组在性别、年龄、BMI构成上无明显差异（P＞0.05）。常见的脑梗死危险因素如高血压病史、糖尿病史、脑卒中家族史、吸烟史及饮酒史，脑梗死组明显高于对照组（P＜0.05）。

1.2 方法

1.2.1 所有入选对象（脑梗死患者）在发病48 h以内，采集清晨空腹静脉血2 ml，由检验科用Hitachi 7170A全自动生化分析仪，测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL－C）低密度脂蛋白（LDL－C）等水平。

1.2.2 ABCA1 R219K基因测定 取肘静脉血5 ml，采用低渗溶血、三氯甲烷法抽提外周白细胞基因组DNA，用多聚酶链式反应（PCR）和限制性片段长度多态性测定ABCA1 R219K基因多态性。10 μl PCR反应体系：基因组DNA0.2～0.5μg，上游和下游引物分别10 pmol，4×dNTP 0.25 mmol，Taq酶0.5 U，10×Taq酶缓冲液1μl，MgCl22 mmol，加灭菌dd－H2O至10μl，震荡混匀。基因扩增过程：预变性94℃4 min；反应循环：变性94℃50 s、退火58℃50 s、延伸72℃60 s，循环32次；最后72℃延伸10 min。20μl限制性内切酶消化反应体系：PCR产物10μl，10×NE Buffer4（含BSA）2μl，内切酶EcoN1 3 U，加灭菌dd－H2O至20μl（表1）。

表1 ABCA1 R219K引物序列、内切酶和基因型酶切片断长度

图1 ABCA1 R219K PCR产物酶切片断8%聚丙烯酰胺凝胶电泳谱5、6、8道：RK型；1、2道：KK型；3、4道：RR型；7道：Marker（pUC19DNA／MSPI）

1.3 统计学处理

采用SPSS10.0软件包。计量资料以均数±标准差（¯x±s）表示，计数资料以百分比表示。两组间比较采用t检验，2组以上采用One way ANOVA检验，用LSD方法进行两两比较。分类资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑梗死组合并糖尿病与对照组合并糖尿病的比较

脑梗死组合并糖尿病的患者比例高于对照组合并糖尿病的患者比例（P＜0.05）（表1）。

表1 脑梗死组合并糖尿病与对照组并糖尿病的比较（例）

2.2 脑梗死合并糖尿病组及对照组合并糖尿病组的血脂比较

脑梗死组组间比较，合并糖尿病组的TG、TC水平高于无糖尿病组（P＜0.05）；对照组组间比较，无糖尿病组的HDL－C水平高于合并糖尿病组（P＜0.05）（表2）。

表2 脑梗死合并糖尿病组及对照组合并糖尿病组的血脂比较

2.3 ABCA1 R219K基因型与脑梗死合并2型糖尿病的关系

根据脑梗死患者及对照组患者有无合并2型糖尿病，将收集的脑梗死患者分为无糖尿病脑梗死组和合并糖尿病脑梗死组，将收集的对照组患者也分为无糖尿病对照组和合并糖尿病对照组。经过卡方检验，合并糖尿病脑梗死组、无糖尿病脑梗死组、合并糖尿病对照组及无糖尿病对照组的ABCA1 R219K各个基因型分布频率比较，无显著性差异（P＞0.05）（表3）。

表3 ABCA1 R219K基因型与脑梗死合并2型糖尿病的关系

3 讨 论

三磷酸腺苷结合盒运转体A1（ATP binding cassette A1，ABCA1）在拮抗动脉粥样硬化以及促进巨噬细胞内胆固醇流出中起重要作用。ABCA1活性增强在胆固醇代谢、胆固醇的逆向转运以及高密度脂蛋白（HDL）代谢的过程中起着极其重要的调节作用。最近的研究表明，细胞内胆固醇水平会影响β细胞功能，作为胆固醇转运体的ABCA1缺乏后胰岛内胆固醇增加并胰岛素分泌受损，这表明胆固醇流出障碍可导致β细胞发生功能障碍；特异地将小鼠胰岛β细胞ABCA1基因敲除后小鼠葡萄糖耐量显著降低，胰岛素分泌明显受损［4，5］。胰岛胆固醇水平分析也表明，胰岛中胆固醇含量增加与β细胞机能失调紧密关联。临床研究发现，ABCA1与2型糖尿病的发生相关联［6，7］。在2型糖尿病患者中经常出现血浆HDL－C水平降低和LDL－C水平升高［8，9］，带有这种双重血脂代谢异常的2型糖尿病患者在我国日益增加［10］。Da－imon和Salinas研究发现ABCA1基因的单核苷酸多态性与2型糖尿病密切相关［11，12］。日本的一项研究也发现ABCA1基因多态性与2型糖尿病的发病相关［4，7］。Alenezi等的研究显示，胰岛素抵抗患者体内成纤维细胞与正常对照相比脂质外流并无明显差异，ABCA1本身可能并不是导致细胞内胆固醇集聚的主要原因［13］。

本研究结果表明脑梗死组合并糖尿病的患者比例高于对照组合并糖尿病患者比例，这可能与糖尿病是脑梗死的危险因素有关。合并糖尿病的脑梗死患者同样出现血脂异常，这提示血脂异常与糖尿病之间存在联系，但与之前的研究结果不一样，这可能与脑梗死的影响因素较多有关。同时更进一步研究表明合并糖尿病脑梗死组、无糖尿病脑梗死组、合并糖尿病对照组及无糖尿病对照组的ABCA1 R219K各个基因型分布频率比较，差异不显著。故认为ABCA1 R219K基因型与脑梗死合并2型糖尿病无明显关系，提示ABCA1 R219K多态性可能不是2型糖尿病发病的遗传学因素。

相对于ABCA1与冠心病及血脂关系的研究而言，对2型糖尿病患者ABCA1基因型的表达及变化的研究仍较少。本研究对ABCA1 R219K基因多态性与湖南汉族人群脑梗死合并2型糖尿病的关系进行了研究。实验并未严格匹配血压、吸烟、饮食等混杂因素，因此有必要对以上因素进行更严格的配比，多中心及扩大研究例数在不同人种中进行研究，并对ABCA1基因其它单核苷酸多态性与脑梗死的关系做进一步的研究。

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3 Evans D，Beil FU.The association of the R219K polymorphism in the ATP－binding cassette transporter 1（ABCA1）gene with coronary heart disease and hyperlipidaemia.Journal of Molecular Medicine（Berlin，Germany），2003，81（4）：264－270.

4 Rutti S，Ehses JA，Sibler RA，et al.Low－and high－density lipoproteins modulate function，apoptosis，and proliferation of primary human and murine pancreatic beta－cells.Endocrinology，2009，150（10）：4521－4530.

5 Brunham LR，Kruit JK，Pape TD，et al.Beta－cell ABCA1influences insulin secretion，glucose homeostasis and Response to thiazolidinedione treatment.Nat Med，2007，13（3）：340－347.

6 Brunham LR，Kruit JK，Verchere CB，et al.Cholesterol in islet dysfunction and type 2 diabetes.J Clin Invest，2008，118（2）：403－408.

7 Brunham LR，Kruit JK，Hayden MR，et al.Cholesterol in betacell dysfunction：the emerging connection between HDL cholesterol and type 2 diabetes.Curr Diab Rep，2010，10（1）：55－60.

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11 Daimon M，Kido T，Baba M，et al.Association of the ABCA1 gene polymorphisms with type 2 DM in a Japanese population.Biochem Biophys Res Commun，2005，329（1）：205－210.

12 Salinas CA，Cruz－Bautista I，Mehta R，et al.The ATP－binding cassette transporter subfamily A member 1（ABC－A1）and type 2 diabetes：an association beyond HDL cholesterol.Curr Diabetes Rev，2007，3（4）：264－267.

13 Alenezi MY，Marcil M，Blank D，et al.Is the decreased highdensity lipoprotein cholesterol in the metabolic syndrome due to cellular lipid efflux defect.J Clin Endocrinol Metab，2004，89（2）：761－764.