大鼠眼球的生物光子检测及其生物学意义*

姜伟业，杨 钊，赵季平

(西北大学生命科学学院，陕西 西安710069)

生物光子是生物体(或细胞)自发的或被诱导而辐射出的一种极微的光子流。代谢活动特别是天然脂质过氧化作用是生物光子的重要来源[1-3]。体内光感受器代谢旺盛，其耗氧量最大，且不饱和脂肪酸含量最高[4]。此外，在视网膜正常功能条件下，外界光线可以引起脂质过氧化作用[5]。因此理论上视网膜不但能够辐射出较强的自发生物光子而且可以辐射出较强的诱发生物光子。

在正常视觉情况下，由于生物光子过于微弱，人眼不能够识别生物光子，但在电、磁、机械等刺激存在的条件下或在视网膜暗适应过程中，生物光子特别是诱发生物光子可能被光感受器细胞所识别。据此，Bókkon等[2,3,6]用光化学理论来解释这些现象，他们认为生物光子可能在光幻视、视觉后像、视网膜暗噪音等现象中扮演重要角色。

然而至今为止，人类或动物的眼睛(特别是视网膜)可以自发的或在可见光诱导下辐射出生物光子的实验证据尚未见报道。在本研究中，我们利用 EM-CCD 为基础构建生物光子检测系统首次对新分离的大鼠全眼、晶状体、玻璃体以及视网膜样品的自发的生物光子和可见光诱导产生的生物光子进行检测，为 Bókkon等提出的假说提供直接的实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及其饲养条件

动物：Sprague -Dawley(SD)大鼠(200±15)g购自中山大学医学院实验动物中心(动物质量合格证编号：No.00006656)。整个实验共使用了12只SD大鼠，其中5只用于预实验，7只用于本研究结果的数据分析。实验对每只动物的一只全眼和从另一只眼分离得到的晶状体、玻璃体、视网膜进行观察。

动物饲养条件：12 h昼夜节律光照，自由饮水、摄食，温度 18～25 ℃，相对湿度40％～50％、过滤要达到 0.5 μm/m3≤5 个、氨浓度/m3≤14 mg，饲料为普通动物饲料，开放式饲养。

1.2 仪器与设备

EM-CCD及其控制器(型号：C9100-13，日本滨松光子学株式会社产)；暗箱(90.5 cm×75.5 cm×110.5 cm，上海艾道艾机械设备有限公司产)；台式计算机(戴尔公司产，内装 Simple-PCI 软件)； 体视显微镜(型号：AZ100，含 AZ-Plan Apo 0.5×镜头，尼康株式会产)；低温冷却液循环泵(型号：DLSB-5L/20，巩义市子华仪器有限责任公司)；蠕动泵(型号：BT100-1 J，保定兰格恒流泵有限公司)；3 mm高亮 LED灯(额定电压3 V；直流供电；红，621～623.5 nm，4 500～5 000 mcd；绿，515～520 nm，12 000～14 000 mcd；蓝，460～465 nm，4 000～5 000 mcd)；高端超纯水系统(型号：AJY-6000-U型，艾科浦公司产)。

1.3 样品预处理

所有的动物实验均通过中山大学动物管理委员会认可。大鼠断头处死后，将眼睛和眼眶迅速分离。在冰水浴的生理盐水中，用显微手术剪将周围结缔组织和残余视神经与眼球仔细分离。在手术显微镜下，用显微手术剪将其中一个眼球的角膜沿角巩缘剪下，并将晶状体、玻璃体与视杯(视网膜)小心分离。另一只将眼睛周围的结缔组织去除后保持全眼，不做分离。

1.4 实验步骤

①按图 1的顺序将样品依次放置在体视显微镜的载物台上，按标准的操作规则启动 EM-CCD，先拍摄定位图像，然后关闭暗箱，避光 20 min以上，以排除环境光引起的诱发光的影响；②将 EM增益设为 1 200，扫描模式设为11 MHz，光子图像模式设为0，Binning 设置为 2×2，10帧/min实时连续拍摄获取组织光子辐射的图像和数据；③拍摄 50帧(即拍摄 5 min)后暂停(结果作为本底光子辐射)，用 LED灯(红色)对样品照射10 s(照射过程中，暂停 EM-CCD采集数据)，然后继续拍摄150帧(即拍摄20 min)；④重复步骤2-3，光照时间分别延长至 20 s和 40 s；⑤分别用绿色 LED 和蓝色 LED 灯替换红色的LED灯，重复步骤2-4。

1.5 图像处理和数据提取

用 EM-CCD配备的图像处理分析软件(Simple PCI 6.0)对图像和数据进行处理，具体过程如下：①如图1A所示将定位图片叠加在数据图像上(这种叠加不影响对图像数据的分析)，并根据定位图片所示的位置、大小用圆圈将样品所处的目标区域圈出；②将灰度阈值设为 10 000，将大于灰度值 10 000 的点用其附近的点替代，这是为了在一定程度上排除宇宙射线的影响；③提取目标区域的平均强度值(图像平均灰度值)。

图1 眼球(及其各部分)诱发光成像和图像分析

1.6 统计学分析

2 实验结果

预实验表明，全眼及分离的眼组织(晶状体，玻璃体和视网膜)在暗室内避光30 min后达到了稳定的本底(包括背景)基值。因此，每次实验在暗室内避光30 min后开始记录300 s的基础值，然后分别用单色的红光、绿光、蓝光 LED 连续照射组织样品(全眼、晶状体、玻璃体、视网膜)10，20和40 s后开始记录诱发光随时间改变的情况。

如图 2 A-C、3 A-C、4 A-C和5 A-C所示，所有样品均具有明显的延迟发光现象，并显示类似的衰减曲线(由峰值迅速下降)，10 min左右后恢复到基础值。整体上来讲，在不同波长的 LED光源照射下，同一波长的 LED光源随着光照时间的延长，组织样品诱发光的峰值强度有递增趋势，但大部分组织在照射20 s后达到了峰值，因而光照20 s与光照40 s相比，其峰值强度没有统计学差异(见图2D、3 D、4 D和 5 D)。提示光照已经基本饱和，进一步延长光照时间不能使诱发光的峰值强度进一步增强。

图 2 光照时间长度对全眼延迟发光的影响

图3 光照时间长度对视网膜延迟发光的影响

图4 光照时间长度对玻璃体延迟发光的影响

图5 光照时间长度对晶状体延迟发光的影响

此外对3种不同波长的光(蓝、绿、红)对全眼和不同眼组织(晶状体、玻璃体和视网膜)照射40 s后，其在1 min之内诱发光强度的衰减情况进行了分析。以每6 s的时段为一个点对每一时段的总发光强度进行了统计学分析。如图7所示，尽管在每一时段点的结果可变性较大，但从整体上看有一定的规律，晶状体和玻璃体与全眼的衰减过程存在明显的差异，而视网膜与全眼的差异不大。

在光子数大致相同的情况下，红光所引起的诱发光要明显弱于绿光和蓝光所引起诱发光，提示红光诱发延迟发光的能力要弱于其他两种光。但这种差异在峰值位置表现最为明显，随着衰减时间的延长，差异逐渐减少以至消失，并最终都恢复到基线水平(图8)。

图6 刺激光源波谱对眼球(及各部分)延迟发光的影响

图7 光刺激 40 s后眼球(及各部分)发光强度比较

图8 视杆细胞离散暗噪声的生物超弱发光(生物光子)理论

3 实验结果的生物学意义

实验表明，新鲜分离的大鼠眼球各部分存在自发光和可见光诱导的延迟发光现象。因此，我们认为在正常条件下，从周围环境进入眼内的光子除直接作用于视网膜产生视觉外，还可以作用于眼球不同的部分导致诱发光(生物光子)，这一部分生物光子以及组织内由于氧化代谢而生成的生物光子与从环境中进入眼内的光线相比可能“微不足道”，然而，但在特定条件下可能有重要的生物学意义，特别是对于理解到目前为止还不清楚的一些视觉现象有重要的价值。

3.1 生物光子与光幻视

新近 Bókkon提出一种光幻视起因的新观点，他认为光幻视是由于眼内氧化代谢产生的自由基和激发态生物分子过量产成进而发出生物光子的结果，并认为这些物质的过量产生可以引起视觉系统各部分中的细胞生物光子的瞬间增强。当这种过量的生物光子超过一定的阈值，在我们脑海中可能就会出现光幻视。换句话说，大脑不能辨别这些光子究竟来自外界还是视网膜本身[7]。

Bókkon 关于视网膜光幻视的假说已经被 Narici等[8]的实验初步证实。根据这项研究，由电离辐射(宇宙射线)诱导生成的自由基可以通过脂质过氧化作用产生化学发光。这些化学发光所产生的光子被光感受器吸收，进而启动光子转导级联反应，从而产生光幻视。

众多前人的实验表明，视网膜光幻视通常由电、磁、机械刺激引起。本研究结果表明，视网膜光幻视可能是由于诱发和自发生物光子作用于视杆细胞的结果。 总之，我们及前人的研究结果表明，视网膜光幻视的出现可能是由于诱发和自发生物光子作用于视觉细胞引起视假象的缘故。

3.2 生物光子与视网膜暗噪音

我们的实验结果表明，在体外，新分离的大鼠眼(包括晶状体、玻璃体、视网膜以及全眼)能够辐射出生物光子。如图3-7所示，晶状体、玻璃体、视网膜和全眼能够连续的基准强度的生物光子。该结果表明，眼球的生物光子具有多源性。在明视觉(Photopic vision)或暗视觉(Scotopic vision)中，连续的生物光子辐射可以忽略。但在视网膜暗适应过程中，生物光子可能起到重要作用。

实验表明，眼睛多个部位都可以连续产生生物光子(生物超弱发光)，这可以在一定程度上支持Bókkon和Vimal提出的视杆细胞离散暗噪声的生物超弱发光(生物光子)假说(参见图8)。虽然作用程度不同，但热激活过程和生物光子在离散暗噪音的形成中可能都发挥作用。此外，当氧化反应所生成生物光子(可漂白或激活色素)的能量低于视色素(Visual pigment)的活化能时，分子的热能或许能够发挥协同作用，共同激活视色素。

1)给定的视锥或视杆细胞可能发出一个生物光子， 光子方向改变后有被其自身吸收。

2)视锥或视杆细胞可以吸收临近细胞中不饱和脂肪酸脂质氧化所发出的光子。

3)视蛋白也可以吸收线粒体氧化代谢过程中所产生的生物光子。

参考文献：

[1]POPP F A,NAGL W,LI K H,et al.Biophoton emission new evidence for coherence and DNA as source[J].Cell Biophysics,1984,6(1):33-52.

[2]RUTH B,POPP F A.Experimental investigations on ultraweak photonemission form biological systems[J].Zeitschrift für Naturforschung C:A Journal of Biosciences,1976,31(11/12):741-745.

[4]QUICKENDEN T I,COMARMOND M J,TILBURY R N.Ultraweak bioluminescence spectra of stationary phase Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe[J].Photochemistry and Photobiology,1985,41(5):611-615.

[5]TAYLOR G W,HARVEY E N.The theory of mitogenetic radiation[J].Biological Bulletin,1931,61(3):281-293.

[6]LORENZ E.Search for mitogenetic radiation by means of the photoelectric method[J].The Journal of General Physiology,1934,17(6):843-862.

[7]韩金祥.基于生物光子相干性理论的经络本质探讨[J].生物医学工程研究,2010,29(3):147-151.