银杏叶提取物后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用的研究

邓永超 刘煜敏

缺血性脑血管病尤其是脑缺血后的再灌注损伤对人类健康危害较大。研究表明药物后处理可产生与缺血后处理类似的脑保护作用，因药物后处理可操作性强，更具有临床意义。已经证实银杏提取物EGb761对中枢神经系统有一定的保护作用［1］。脑组织微管相关蛋白（MAP2）作为神经细胞的骨架成分，参与神经元的生长和损伤后的修复过程，同时对缺血也极其敏感［2］。本研究通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，并用银杏叶提取物进行后处理，然后观察缺血再灌注脑组织中MAP2的表达水平来探讨银杏叶提取物对神经的保护作用及其机制，为其治疗脑缺血再灌注损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

银杏叶提取物（EGb761）（德国Schwade制药公司）；Western Blotting Ecl试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）；兔抗鼠MAP2多克隆抗体、辣根过氧化酶标记的山羊抗兔多克隆抗体（美国Cell Singling公司）。

1.2 动物分组与模型建立

健康雄性SD大鼠30只，体重300～320 g，由武汉大学动物中心提供。实验前禁食12 h，自由饮水，采用随机数字表法，将其随机分为3组，即假手术组（n＝10）：给予5 ml生理盐水腹腔注射；对照组（n＝10）：缺血90 min，再灌注24 h，5 ml生理盐水腹腔注射；实验组（n＝10），缺血90 min，再灌注24 h，在再灌注即刻大鼠腹腔注射20 mg／kg银杏叶提取物稀释5 ml。

采用线栓（Longa）法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型［3］。经腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg／kg）实施麻醉，每隔90 min追加注射20 mg／kg；颈部备皮、消毒，取颈正中切口，暴露和游离右侧颈总动脉，并置入尼龙线栓，经动脉分叉推送线栓进入颈内动脉，遇到阻力明显表明线栓头端已阻断大脑中动脉，阻断90 min，再灌注24 h。

1.3 指标测定

1.3.1 于再灌注24 h后进行神经功能缺损评分（NDS）［3］：0级，无神经功能缺损症状；1级，轻度局灶性神经功能缺损，即提尾悬空时不能伸展左前肢；2级，中度局灶性神经功能缺损，即行走时向左侧偏转；3级，重度局灶性神经功能缺损，即行走时向左侧倾倒；4级，昏迷，不能自行行走。

1.3.2 大鼠脑组织－20℃冷冻30 min，冠状位切割成厚度为2 mm的薄片，经1%TTC染色20 min，10%甲 醛 固 定24 h。采 用Image－Pro Plus 5.02图像分析软件计算脑梗死体积（测定的脑梗死体积／同侧大脑半球体积×100%）。

1.3.3 采用蛋白印迹分析技术测定缺血侧和健侧脑组织MAP2表达水平 取大鼠脑缺血侧和对侧组织标本，全层皮质称重，每100 mg脑组织加1 mL裂解液制备组织匀浆，离心取上清液定量。经电泳和转膜后进行封闭和杂交，一抗为兔抗大鼠MAP2抗体（1∶1000）孵育1 h，二抗为辣根过氧化酶标记的山羊抗兔多克隆抗体（1∶1000）孵育1 h，采用辣根过氧化物酶HRP－ECL发光法进行显色。采用Image—Pro Plus 5.02图像分析软件对上述显影的X线片做图像灰度扫描，将假手术组脑组织MAP2蛋白条带灰度的平均数设为正常值，各组脑组织MAP2表达水平以其蛋白条带灰度值与正常值的百分比表示。

1.4 统计学处理

所有数据均在SPSS13.0统计软件分析。计量资料用均数±标准差（¯x±s）表示；组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠NDS评分

假手术组、对照组和实验组大鼠NDS评分分别为（0.18±0.05）分、（2.49±0.85）分 和（1.58±0.62）分，对照组和实验组NDS评分较假手术组均显著升高，实验组NDS评分较对照组明显下降，3组间比较差异均明显（P＜0.05）。

2.2 3组大鼠脑梗死体积比较

与假手术组比较，对照组、实验组脑梗死体积均显著增大；与对照组比较，实验组脑梗死体积显著减小，3组间比较差异均明显（P＜0.05）（表1）。

表1 3组大鼠脑梗死体积与同侧大脑半球体积的比值比较（¯x±s，n＝5，%）

2.3 3组大鼠脑组织MAP2蛋白的表达水平

与假手术组比较，对照组、实验组缺血侧MAP2蛋白的表达水平均显著降低；与对照组比较，实验组缺血侧MAP2蛋白的表达水平显著升高，3组间比较差异均明显（P＜0.05）（表2）。

表2 三组大鼠MAP2蛋白表达水平的比较（¯x±s，n＝5，%）

3 讨 论

机体组织器官正常代谢、功能的维持依赖于良好的血液供应。现如今脑血管病是临床首位致残因素，其中缺血性脑血管病约占全部脑卒中的70%。缺血性脑血管病尤其是缺血后的再灌注损伤对人类健康危害较大。研究表明缺血后处理和预处理一样，可以通过减少氧自由基途径而有效减轻缺血再灌注损伤，尤其在早期，而且比预处理更有效调控［4，5］。药物后处理作为其重要方式，以其无创优点显示出更好的前景。王小姗等人采用银杏提取物EGb761混合处理后发现其具有脑缺血保护作用［6］。故本研究采用银杏提取物EGb761后处理来探讨其脑保护作用及其机制。

本实验结果表明大鼠脑缺血再灌注损伤予以银杏提取物EGb761处理后明显降低NDS评分，改善大鼠脑梗死后的神经功能症状。微管相关蛋白2（MAP2）是神经细胞的骨架成分，在大鼠的神经元中表达丰富，MAP2参与神经元的生长和损伤的修复过程，对缺血相当敏感［7，8］。MAP2表达增强则有助于维持神经元结构的完整性，是神经元的保护反应，提示神经元对伤害性刺激耐受性提高，这可能与NMDA受体活性相关［8］。MAP2减少被认为是缺血神经元Ca2＋内流增加、激活钙调蛋白水解酶和水解细胞骨架蛋白的结果［9］。本研究结果表明经银杏叶提取物EGb761后处理后能明显改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的神经缺损，减少脑梗死体积，MAP2表达水平明显升高。对于银杏叶提取物对脑保护的研究，Tang等研究认为银杏提取物能部分恢复实验鼠脑海马回记忆和乙酰胆碱活性，但不能恢复生长激素释放抑制激素水平，由此推论银杏提取物通过影响胆碱能系统来保护大脑免受β－淀粉样蛋白的损伤［10］。另外，银杏提取物可通过抑制胶质纤维相关蛋白（GFAP）的生成及减少促凋亡基因bax的表达［11］，抑制血小板活化蛋白（PAF）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达［12］来减轻缺血再灌注损伤。本研究证实了银杏提取物后处理在缺血再灌注24 h后的神经保护效果，但未对银杏提取物后处理的神经保护作用进行长期观察，这种保护作用是否持续存在以及保护机制的作用靶点如何等还有待深入研究。

总之，银杏提取物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有显著的保护效应，其效应可能与MAP2蛋白表达水平升高有关。

1 邵继平，王伯除，陈 欣，等.银杏提取物药用价值的研究进展.重庆大学学报，2003，26（1）：130－133.

2 Creed L，Mary L，Susan D.Microtubular proteolysis in focal cerebral ischemia.Cereb Blood Flow.Metab，1996，16：1189－1197.

3 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat.Strkoe，1989，20：84－91.

4 Cai M，Li Y，Xu Y，et al.Endothalial NOS activity and myocardial oxygen metabplism define the salvageable ischemic time window for ischemic postconditioning.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300（3）：H1069－H1077.

5 Balakumar P，Pohilia A，Singh M.Pre－conditioning and postconditioning to limit ischemia－reperfusion－induced myocardial injury：What could be the next footstep？Pharmacol Res，2008，57（6）：403－412.

6 王小姗，狄 晴，曹 辉，等.银杏提取物对脑缺血再灌注鼠脑保护作用的研究.临床神经病学杂志，2006，19（1）：53－55.

7 Deborah A，Dawson，John M.Acute focal ischemia induced MAP2 immunostai－ning：description of immunostaining：description of temporal change and utilizat－ion as a marker for volumetric assessment of acute brain injury.Cereb Blood Flow Metab，1996，16：170－178.

8 Bibot D，Matus A.Reorganization of the cytoskeleton in rat neurons fo11owing stimulation with excitatory aminoacid.Eur J Neurosci，1991，3：551－558.

9 Popa－Wagner A，Schroder E，Schmoll H.Upregulation of MAPIB and MAP2in the rat brain after middle cerebral artery occlusion：effeet of age.Cereb Blood Flow Metab，1999，19：425－434.

10 Tang F，Shiu S，Nag SYW，et al.The effects of melatonin and Ginkgo biioba extract on memory loss and choline acetyltransferase activities in the brain of rats infused intracerebroventricularly withβ－amyioid 1～40.Life Sciences，2002，71（22）：2625－2631.

11段长虹，付庆林，王崇军，等.银杏提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤bax、神经胶质纤维相关蛋白表达的影响.中华实验外科杂志，2012，29（1）：97－99.

12段长虹，付庆林，蕲国庆，等.银杏提取物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤诱导型一氧化氮合酶和血小板活化因子表达的影响.中华实验外科杂志，2012，29（2）：259－261.