葡萄糖甘氨酸美拉德反应产物对脂肪氧合酶的抑制作用研究

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(合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥 230009; 安徽省农产品精深加工重点实验室,安徽合肥 230009)

脂肪氧合酶(Lipoxygenase,EC l. 13. 11. 12,简称LOX),是一种含非血红素铁的氧化还原酶,可专一催化含顺,顺 - 1,4 - 戊二烯结构的不饱和脂肪酸(或酯),产生共轭不饱和脂肪酸氢过氧化物[1]。LOX广泛存在于动植物界中,豆科植物中具有较高活力,在大豆中含量最高。LOX催化产物氢过氧化物可以进一步裂变形成醛、酮等二级氧化产物或者是经氧化生成环氧酸,这些氧化产物可导致油脂和含油食品在加工和储藏过程中色、香、味的劣变[2],以及大豆与豆制品产生豆腥味[3]。目前,LOX的抑制剂主要是化学试剂(如BHA、BHT、NaN3等)以及天然提取抗氧化物(如儿茶素、黄酮类、花青素等)[4],这些抑制剂制取繁琐,成本大。

美拉德反应(Maillard reaction,MR),又称非酶褐变反应,指的是氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白质)与羰基化合物(糖类)经过一系列复杂反应,生成还原酮、含氮含硫杂环化合物以及类黑精等产物的过程[5]。20世纪80年代以来,美拉德反应产物(MRPs)由于具有较强抗氧化性而备受关注。其对一些氧化还原酶如多酚氧化酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等具有较强抑制作用[6 - 9],但对LOX的影响还未见报道。本文以亚油酸作为酶反应底物,研究了Glu/Gly - MRPs对LOX的抑制作用及机理,为拓展MRPs的应用,开发LOX天然抑制剂提供了理论依据。

西藏自治区财政性教育经费的投入从2010的63.35亿元上升到2016年的175.83亿元，净增长112.48亿元。同时，教育经费占地区生产总值的比重也在呈现增长趋势。见表2。

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

低温脱脂豆粕 购于河南漫天雪蛋白有限公司;亚油酸 购自成都格雷西亚化学技术有限公司;甘氨酸 购自于北京索莱宝科技有限公司;硫酸铵、葡萄糖、氢氧化钠、硼酸、无水乙醇等 购于国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。

数字恒温水浴锅HH - 4 国华电器有限公司;手提式蒸汽灭菌锅SYQ. DSX - 280B 上海申安医疗器械厂;pH计PHS - 3C 上海仪电科学仪器股份有限公司;可见光分光光度计721G 上海精科仪器有限公司;紫外分光光度计UV1201 北京瑞利分析仪器公司;分析天平CP114 奥豪斯仪器有限公司;台式高速冷冻离心机 美国Beckman公司。

1. 2. 5. 3 具体测定方法是 实验组:取0. 2mL一定浓度的LOX酶液于试管中,加入MRPs 50μL,30℃水浴恒温静置30min后,加入1. 5mL亚油酸底物,混匀,30℃水浴恒温反应3min,加入5mL无水乙醇终止反应,最后加入5mL蒸馏水稀释,在234nm下测定吸光值。空白组:在加入底物前添加5mL无水乙醇使酶失活。

1. 2 实验方法

1. 2. 7 数据处理方法 所有实验每个样做3个平行,实验结果取平均值,采用Excel及origin软件对实验数据进行处理和分析。

1. 2. 2 MRPs的制备 取一定体积0. 5mol/L的葡萄糖水溶液至具塞三角瓶中,加入等体积的一定浓度的甘氨酸水溶液,调整溶液初始pH(加热反应过程中不调整pH)。盖紧塞子防止加热过程中水蒸气的蒸发,在蒸汽式灭菌锅中进行反应。以甘氨酸浓度、初始pH、反应温度和时间为单因素制备不同的MRPs。制备好的MRPs置于4℃冰箱密封保存备用。

1. 2. 4 褐变程度的测定 将样品稀释一定倍数后,以蒸馏水为对照组调零,测定样液在420nm处的吸光值。

1. 2. 2. 2 不同初始pH的MRPs的制备 控制甘氨酸浓度、反应温度和反应时间分别为0. 6mol/L、110℃和4h,调初始pH分别4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0制备MRPs。

2.涉及油田的行政事业性收费被取消。2011年12月财政部、发改委发布《关于公布取消253项涉及企业行政事业性收费的通知》（财综〔2011〕127号）。其中，如山东省财政厅、物价局转发了该文件，取消了19项涉企行政事业性收费，其中取消了涉及胜利油田的落地原油管理费、工农工作协调费、水工程占用补偿费、石油勘探开发排污费等有12项费用，进一步缓解了油田生产经营压力。

1. 2. 2. 3 不同反应温度的MRPs的制备 控制甘氨酸浓度、初始pH和反应时间分别为0. 6mol/L、7. 0和4h,分别在80、90、100、110、120℃下制备MRPs。

1. 2. 2. 4 不同反应时间的MRPs的制备 控制甘氨酸浓度、初始pH和反应温度分别为0. 6mol/L、7. 0和110℃,反应0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、3. 0、4. 0、6. 0h制备MRPs。

1. 2. 3 反应产物pH的测定 取一定反应液,快速冷却至室温后,用pH计测定pH。

1. 2. 2. 1 不同甘氨酸浓度的MRPs的制备 控制初始pH、反应温度和反应时间分别为7. 0、110℃和4h,取0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0mol/L的甘氨酸溶液分别制备MRPs。

1. 2. 5 LOX活性抑制测定(分光光度法[11])

还需提及，南海区域也是日本拓展地缘政治影响力的重要场域。对于日本而言，东北亚因有俄罗斯、中国等大国的存在，所以其主要的地缘政治空间首选南海及周边东南亚地区。在南海周边地区，日本更希望维持美军存在基础上的美日同盟安保秩序，不愿看到其他国家主导这一海域，因为这将大大削弱日本在南海区域地区事务中的角色，因此对中国在南海海域的维权行动视为“威胁”，并逐步升级实施“对华对冲战略”。[20]

1. 2. 5. 2 酶活定义 把30℃,pH9. 0下,以亚油酸为底物的3mL反应体系在234nm处每分钟增加0. 001吸光度值定义为一个酶活单位。

跨越三个世纪的商务印书馆，在现代文化史上确是一个传奇之存在，就印刷领域而言，凭借着“第一个采用珂罗版印刷”“第一个采用电镀铜版印刷”“第一个使用自动铸字机”“第一个采用胶版彩色印刷”等不可忽视之所为，似乎走出了现代印刷的发展轨迹。而几经改名、改制所成就的今日之商务印书馆上海印刷股份有限公司（以下简称“商务公司”），亦以百年沉淀续写着印刷未来之无限可能。当坐在我们面前的商务公司总经理蒋树新，在谈及过往之荣耀与未来之畅想时，一种作为商务人固有的荣誉感与责任感呼之欲出。

镇海炼化公司1 Mt乙烯装置裂解气压缩机采用美国通用电气公司的压缩机，机组体积大、结构复杂，分别由低压、中压、高压3缸五段串联组成，具有压比高、流量大等特点，驱动机的额定功率达到60.28 MW，是目前中国功率最大的裂解气压缩机组之一，在整个乙烯装置起着关键作用；该压缩机将急冷水塔送来的0.031 MPa，40 ℃裂解气，经五段压缩后，将压力提高到4.026 MPa，为深冷分离提供条件。压缩机控制流程主要包括： 供油系统、干气密封系统、盘车装置及压缩机组启停控制。

抑制率(%)=(不加抑制剂吸光值 - 加抑制剂吸光值)/不加抑制剂吸光值×100

1. 2. 6 抑制动力学的研究 在1. 2. 2的基础上,取0. 6mol/L甘氨酸溶液在初始pH为7. 0,110℃下与等体积0. 5mol/L葡萄糖溶液反应4. 0h制备MRPs。取制备的MRPs加蒸馏水配制成体积分数为20%、40%、60%、80%的MRPs稀释液,分别取50μL上述4种MRPs稀释液、蒸馏水(MRPs浓度为0)以及MRPs样液(浓度为100%)添加到酶促反应体系中,跟踪OD234的变化,计算反应速率,进行迟滞曲线绘制及抑制动力学的研究。

2 结果与讨论

2. 1 不同甘氨酸浓度合成的Glu/Gly - MRPs的pH、褐变程度以及对LOX的抑制率分析

图1 甘氨酸浓度对Glu/Gly - MRPs的最终pH和褐变程度的影响Fig. 1 Effect of glycine concentration on final pH and browning degree of Glu/Gly - MRPs

MR的主要终极产物—类黑精在420nm下具有最大吸光值,因此该波长下的吸光值也是反应进行程度的表征,被广泛用来衡量产物的褐变程度[12 - 13]。由图1可知随着甘氨酸浓度的增大,Gly/Glu - MRPs的pH呈下降趋势,褐变程度呈先缓慢上升后急剧加快的趋势。这是由于甘氨酸的碱性基团 - 氨基在加热的过程中不断地与还原糖的羰基进行缩合,使得游离的氨基被封闭,同时生成的有机酸,致使体系的pH不断下降[14]。同时甘氨酸浓度越大,反应越完全,终产物黑色素越多。

路上，他如常地看报纸，却不再专心，总是抬头来偷看她，与她对话。她就淡淡地应着，然后她接到他的邀约：晚上一起吃饭。

由图2可知随着甘氨酸浓度的增大,MRPs对LOX的抑制率增大,当甘氨酸浓度到达0. 6mol/L时抑制率达到87. 1%,高于0. 6mol/L之后抑制率变化不大,因此后续实验选取0. 6mol/L作为Glu/Gly -MRPs制备浓度。

图2 不同甘氨酸浓度合成的Glu/Gly - MRPs对LOX的抑制率Fig. 2 Effect of glycine concentration on inhibition rate of Glu/Gly - MRPs

2. 2 不同初始pH合成的Glu/Gly - MRPs的pH、褐变程度以及对LOX的抑制率分析

由图3可知Glu/Gly - MRPs的最终pH均较初始pH有所降低,且随着初始pH的增大,pH下降幅度越明显。褐变程度呈先缓慢上升后急剧加快的趋势。这与Ajandouz等[15]的结果一致。这是由于中性和碱性条件下,氨基阴离子的存在使得羰氨反应更容易进行。

图3 初始pH对Glu/Gly - MRPs的最终pH和褐变程度的影响Fig. 3 Effect of initial pH on final pH and browning degree of Glu/Gly - MRPs

由图4可知随着反应体系初始pH的增加抑制率增大,当初始pH达到7. 0时抑制率趋于平稳,pH为9. 0时,抑制率达到99. 8%,考虑到实际情况中,LOX酶促反应在中性条件居多,因此后续实验选取7. 0为反应初始pH制备MRPs。碱性条件下生成较多的褐色物质,这些都可能是具有LOX抑制活性的物质。

图4 不同初始pH合成的Glu/Gly - MRPs对LOX抑制率Fig. 4 Effect of initial pH on inhibition rate of Glu/Gly - MRPs

2. 3 不同反应温度合成的MRPs的pH、褐变程度以及对LOX的抑制率分析

由图5可知随着反应温度的升高,Glu/Gly -MRPs的最终pH降低,A420在80 ～ 100℃范围非常小且几乎没有变化,110 ～ 120℃急剧上升。这说明高温下反应速度大为加快,美拉德反应更加彻底。该结果与吴惠玲等[16]一致。

1. 2. 5. 1 底物的配制 将0. 25mL吐温20分散于10mL pH为9. 0的0. 2mol/L硼酸缓冲液中再加入0. 27mL亚油酸,充分混合,加入1mol/L的氢氧化钠使体系澄清,调节pH为9. 0,然后用上述硼酸缓冲液稀释到500mL作为底物待用。

图5 反应温度对Glu/Gly - MRPs的最终pH和褐变程度的影响Fig. 5 Effect of reaction temperature on final pH and browning degree of Glu/Gly - MRPs

由图6可以看出随着温度的升高抑制率上升。当反应温度处于80到100℃时,虽然褐变程度低且变化不大,但是抑制率仍上升较快,110 ～ 120℃抑制率趋于平稳,可选取110℃为最佳反应温度。分析其原因为:低温时生成小分子量的产物[17],这种小分子量的物质对LOX也有一定的抑制作用。当温度高于110℃时,大分子的聚合物在LOX的抑制中起到主要作用。

那天公司完成了一个大项目，白阳提议去吃饭庆祝。饭桌上何冰快乐得不得了，对白阳说：“我们俩的合作简直就是双剑合璧，天下无敌。”

图6 不同反应温度合成的Glu/Gly - MRPs对LOX抑制率Fig. 6 Effect of reacting temperature on inhibition rate of Glu/Gly - MRPs

2. 4 不同反应时间生成的MRPs的pH、褐变程度以及对LOX的抑制率分析

美拉德反应在初级阶段,反应只要生产无色无味小分子物质,高级阶段继还原糖、糠醛和不饱和羰基化合物产生后开始形成无氮和含氮褐色可溶性化合物,最终阶段中,前两个阶段形成的物质继续与氨基酸反应生成类黑精色素 - 褐色含氮色素[18]。因此随着美拉德反应时间的延长,Glu/Gly - MRPs的褐变程度加强。由图7可知随着反应时间的延长,Glu/Gly - MRPs的最终pH降低,褐变程度呈上升趋势。反应产物对LOX的抑制率在反应时间大于3h后趋于平稳,抑制作用趋于饱和,因此选取3h作为最佳反应时间。美拉德反应时间越长,反应体系里面的类黑精以及还原酮等具有抑制活性的物质越多。

图7 反应时间对Glu/Gly MRPs的最终pH和褐变程度的影响Fig. 7 Effect of reacting time on final pH and browning degree of Glu/Gly - MRPs

图8 不同反应时间生成的Glu/Gly - MRPs对LOX抑制率Fig. 8 Effect of reacting time on inhibition rate of Glu/Gly - MRPs

2. 5 抑制动力学研究

不同Glu/Gly - MRPs浓度下,酶反应的进程曲线如图9。由图9可看出在相同反应时间下,反应液的吸光度随着MRPs的浓度的增大有所下降。迟滞时间为进程曲线的直线部分相交于横轴的值,MRPs的浓度和迟滞时间关系如表1。Glu/Gly - MRPs对LOX具有明显的迟滞效应,酶反应迟滞时间由不添加MRPs的64s延长至173s,迟滞时间随着MRPs的浓度的增大而增大。

图9 不同浓度Glu/Gly - MRPs(v/v)对LOX抑制作用的进程曲线Fig. 9 Progress curves for inhibition against LOX by Glu/Gly - MRPs

本研究进一步探讨了Glu/Gly - MRPs对LOX的抑制类型。通过改变底物亚油酸的浓度,测定酶在不同MRPs浓度作用下的催化活力得出Lineweaver -Burk双倒数图如图10所示。各MRPs浓度下双倒数拟合方程、米氏常数(Km)和最大速度(vm)如表2所示,vm随着Glu/Gly - MRPs的浓度增大而减小,Km随着Glu/Gly - MRPs的浓度的增大而增大,由此判断该抑制作用属于混合型。

表1 Glu/Gly - MRPs对LOX迟滞时间的影响Table 1 Effect of Glu/Gly - MRPs on the lag time of LOX

图10 Glu/Gly - MRPs对LOX抑制的Lineweaver - Burk图Fig. 10 Lineweaver - Burk plots for inhibition of Glu/Gly - MRPs on LOX

混合型抑制的Lineweaver - Burk双倒数方程形式为:

我国经济的高速发展对电能的数量和质量提出了更高的要求，致使电力调度问题被推上舆论的风口浪尖。实现网络技术在电力调度工程中的应用，不仅是信息时代发展的要求，更是我国经济发展迈上新台阶的要求。虽然网络技术的普及诱发了一系列的信息安全问题，但实现电力调度的信息化是利国利民的举措。

其中,KI为抑制剂对游离酶的抑制常数,KIS为抑制剂对酶 - 底物络合物的抑制常数。二次作图,以双倒数图的斜率和纵轴截距对MRPs浓度作图为直线,分别求出MRPs的KI为16. 41mmol/L,KIS为13. 83mmol/L。混合型抑制说明LOX催化亚油酸氧化过程中,Glu/Gly - MRPs不仅能与游离LOX结合,还能与LOX - 亚油酸络合物结合。

3 结论

本实验结果表明,Glu/Gly - MRPs对LOX具有较强抑制作用,并且抑制作用随着反应中甘氨酸浓度、反应初始pH、反应温度和反应时间的增大而增强,等体积0. 6mol/L的甘氨酸溶液与0. 5mol/L葡萄糖溶液在初始pH为9. 0,110℃下反应3h制备的MRPs对LOX的抑制率达99. 8%。Glu/Gly - MRPs对LOX酶催化反应有明显的迟滞效应,双倒数图表明抑制作用为混合型抑制。

表2 Glu/Gly - MRPs对LOX的抑制动力学参数Table 2 Kinetic parameters of LOX inhibited by Glu/Gly - MRPs

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