食源性蛋白酶抑制物的筛选及对白鲢鱼糜凝胶特性的影响

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(1. 江南大学食品学院 食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122; 2. 福建安井食品股份有限公司，福建厦门 361022;3. 无锡华顺民生食品有限公司,江苏无锡 214218)

近年来,水产蛋白的精深加工已然成为鱼类产品系列化、多样化和高值化发展的新趋势。鱼糜制品作为一种主要的水产食品,深受国内外消费者喜爱。然而,多年来我国的鱼糜制品整体存在品质不稳定、种类单一等问题,仅以较低的价格在国际市场上占有较小份额[1]。因此,研究如何提高产品品质、丰富产品类型是我国鱼糜制品行业长足发展的根本途径。凝胶特性是反映鱼糜制品品质优劣的关键因素,直接影响了制品的组织特性、保水性、黏结性及产品得率[2]等。已证实的鱼肉中引起凝胶劣化作用的内源性蛋白酶为肌浆型蛋白酶类(sarcoplasmic type proteases,STP)与肌原纤维结合型蛋白酶类(myofibril - bound proteinase,MBP)。前者为水溶性蛋白酶,可经漂洗等工艺去除,而后者不能通过漂洗有效去除,是引发鱼糜凝胶劣化现象的重要相关酶类[3],其中,内源性丝氨酸蛋白(myofibril - bound serine proteinase,MBSP)被证实能够降解肌原纤维蛋白和构成细胞支架的网状结构[4]。因此,国内外研究人员开始从天然物料中提取丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease Inhibitors,SPI)。Maysoon Rassam等[5]在猕猴桃种皮和籽中分离纯化出了一种SPI,与半胱氨酸蛋白酶具有较高同源性;廖海等[6]发现决明子中含有一种具有较强抗还原能力的胰凝乳蛋白酶抑制剂,是SPI的一种。但该类抑制物多用于人体抗肿瘤及结构学方面的研究。郭强等[7]以四种常见鱼籽为研究对象,采用分离纯化手段获得了SPI,并证实了其具有耐高温、耐酸碱的特性,提出了通过外源性添加鱼籽以抑制鱼糜制品凝胶劣化现象的设想。

利用外源性添加物来改善鱼糜凝胶特性的研究较多,主要集中在淀粉、非肌肉蛋白及水溶性胶等方面[8 - 10],同时也有添加外源性酶类[11 - 12]和酶抑制剂[13 - 15]的报道。但通过直接添加食源性物料,进而抑制凝胶劣化、改善鱼糜凝胶特性的研究相对较少。食源性物料及其提取物在鱼糜制品中的研究主要聚焦在蛋白酶的抑制物层面,涉及的物料涵盖植物和动物来源。其中,植物来源添加物,如大豆分离蛋白,凭借较低的价格和良好的效果,被广泛应用到鱼糜制品中[16]。动源性添加物,如乳清蛋白,鸡、牛、猪血浆蛋白等曾被应用到鱼糜制品中[17 - 19],起到了抑制蛋白酶活、降低凝胶劣化程度的作用。但其成本较高、存在食用风险且产品颜色和风味易受到影响,在企业实际生产中受到了一定程度的限制。

本文针对上述问题,以淡水白鲢鱼鱼糜为研究对象,旨在筛选出食用安全、成本适宜且具有抑制肌原纤维结合型蛋白酶类(MBP)酶活作用的食源性物料。从而改善鱼糜制品的质构特性,优化鱼糜制品的风味及营养,为工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与设备

AA级白鲢鱼糜( - 20℃冻结保藏) 福建安井食品股份有限公司;精制食用盐(氯化钠≥99. 1g/100g:碘含量18 - 33mg/kg) 江苏省盐业集团有限责任公司;白糠、黄糠、大米粉 江西金农米业;胡萝卜、番茄、鲫鱼鱼籽 无锡万达华联超市。

斩拌机、灌肠机、封口机 福建安井食品股份有限公司;TA - XTPluS质构仪 英国SMSTA;AL204型电子天平 梅特勒 - 托利多仪器上海有限公司;精密水浴槽 无锡旭野科技有限公司;UNIBERSAL32R冷冻离心机 众友食品科技有限公司;恒温双槽循环水浴锅 南京先欧仪器有限公司;HR2096型食品组织捣碎机 荷兰飞利浦(Philips);2. 5L自动压盖式冷冻干燥机 美国LABCONCO;FD53型热风循环烘箱 BINDER公司。

1.2实验方法

1. 2. 1 凝胶劣化温度的评价方法 参照文献[20]的方法,冷藏白鲢鱼糜经4℃过夜解冻后,取每份400g于斩拌机中进行斩拌。空斩5min后添加3%食盐,盐斩10min,灌肠后分别在40、50、60、70、80、90℃的恒温水浴中加热30min,90℃水浴中熟化20min。经质构分析,凝胶强度最低值对应的温度即为凝胶劣化的最适温度。

1. 2. 2 水分梯度实验 设计水分梯度实验,分别添加鱼糜样品质量分数的5%、10%、15%、20%与40%的水,在盐斩过程中分三次加入,经排气、灌肠、加热、过夜冷藏后测其凝胶强度。

1. 2. 3 水分含量的测定方法 水分测定根据GB 5009. 3—2010执行[21]。大米粉、黄糠、白糠按照固体食品水分含量测定法,称取5g左右试样(精确至0. 0001g);胡萝卜、番茄沸水快煮去皮后放入搅拌机中匀浆,取10g样品放入称量瓶中,加入定量无水硫酸钠用玻璃棒搅拌均匀,以增加粘稠样品的蒸发表面积;白鲢鱼糜解冻后切成2mm薄片,称取5g左右试样。样品加盖后精密称量,记为m1。后置于101 ～105℃干燥箱中,瓶盖斜支于瓶边,干燥2 ～ 4h后盖好取出,放入干燥器内冷却0. 5h后称量。然后再放入101 ～ 105℃干燥箱中干燥1h左右取出,放入干燥器内冷却0. 5h后再称量。重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg,即为恒重。取最后一次的称量值,记为m2。计算公式为:

x(%)=(m1-m2)/(m1-m0)×100

(1)

1. 2. 4 冷冻干燥样品的制备 将番茄、胡萝卜热烫后去皮,凉水中冷却;鱼籽去脂肪层,清水冲洗;匀浆后分别平铺于玻璃大皿中,覆盖保鲜膜, - 20℃过夜冷藏后置于冷冻干燥机中,将冻干样品存放于干燥器中待用。

1. 2. 5 凝胶强度的测定方法 水浴加热处理后的鱼糜肠用冰水冷却至常温,4℃过夜冷藏。剥去肠衣,均切成25mm高圆柱体,质构仪采用球形探头P5/S,设定参数为测前速率2. 0mm/s,测试速率1. 0mm/s,测后速率10. 0mm/s,下压距离15mm,触发力5g。以60. 00mm/s速度穿刺样品至15mm处,取8 ～ 10组平行,测其破断力、破断距离,计算出凝胶强度,取平均值[22]。破断力(breaking force,g):穿刺曲线上的第一个峰值;破断距离(breaking distance,mm):与破断力对应的横坐标为破断距离;凝胶强度(gel strength,g·cm)=破断力×凹陷距离。

1. 2. 6 样品持水率的测定方法 参照Hong等[23]的研究方法,将过夜冷藏的鱼糜剥去肠衣,切成约2mm薄片,称量约5g的样品置于两层滤纸上,样品重量记为m1,用滤纸包好后置于离心管中,20℃、5000r/min条件下离心20min,除去滤纸,再次称量样品质量,记为m2,两组平行实验后取平均值。持水率计算公式为:

x(%)=m2/m1×100

(2)

1. 2. 7 数据处理 数据采用平均值±标准偏差的形式,方差分析及多重比较采用SAS 8. 0软件。

表1 物料的水分含量、添加量及补水量Table 1 The moisture content,additive amount and additional water amount of different materials

2 结果与分析

2.1凝胶劣化最适温度的确定

为了研究食源性物料对鱼糜凝胶强度的影响,选择在加热过程中凝胶劣化现象最严重的温度下进行研究。不同温度二段式加热后样品的凝胶强度如图1所示。

图1 不同二段式温度组合凝胶强度变化曲线Fig. 1 The curves of gel strength in different 2 - phase composite - temperature

由图1可知,随着第一段加热温度的升高,鱼糜的凝胶强度大幅度减小,60℃时达到最低点,此时凝胶劣化程度最为严重,继续升温至90℃,凝胶强度有所回升,但始终低于40 ～ 90℃二段式加热条件下鱼糜样品的凝胶强度。分析原因为40℃是鱼糜内源性TG酶的最适温度[24],可催化蛋白交联反应,大部分水分子截留在其催化形成的三维网状结构中,使鱼糜具有较高的弹性,样品具有最高的凝胶强度。随着温度的升高热量激活了部分可催化鱼糜自溶作用的内源性蛋白酶,如MBP等,在60℃左右达到该酶的最高活性[25],因此凝胶劣化程度升高。继续加热,直至超过该类蛋白酶的最适温度,热钝化作用加剧,凝胶强度逐渐回升。Tanaji Kudre等[26]通过测定TCA - 可溶性肽含量研究了沙丁鱼糜凝胶劣化温度,发现65℃加热30min,90℃熟化20min后蛋白水解严重,凝胶劣化程度最高,与研究中得出的60℃加热30min,90℃熟化20min为白鲢鱼糜的凝胶劣化最适温度的结论相符,下文实验均在该温度条件下进行。

2.2水分含量对鱼糜凝胶强度的影响

水分含量对于鱼糜制品的凝胶强度、白度等指标都有较大影响,但现有的关于添加物料以提高鱼糜制品凝胶强度的研究中,多未考虑水分含量的影响因素[27 - 30]。水分梯度实验结果如图2所示。

图2 不同水分添加量鱼糜凝胶强度变化曲线Fig. 2 The strength of modori gel from silver carp added with water at different levels

由图2可见,水分含量对鱼糜凝胶强度的影响较大,随添水量的增加呈递减趋势;分析其原因为水分的添加使蛋白质的相对含量减少,交联程度降低,从而影响了其凝胶破断强度。由于少量的水有助于食盐的溶解,使得斩拌过程中肌原纤维蛋白盐溶作用增强,更易形成纤维网状结构,提高鱼糜的持水率。而当添水量达到15%,即总水分含量超过81%时,多余的水分将从整体上降低鱼糜的粘稠度,故鱼糜凝胶强度的下降趋势随着添水量的增多而愈加明显。

2.3不同食源性物料等水分添加效果对比

由于不同物料的水分含量差别较大,且已证明水分是影响鱼糜制品凝胶强度的重要因素,因而以最终水分含量为总质量的80%计算,依照方法1. 2. 3对所选食源性物料的水分含量进行测定,按照公式(1)进行计算,得出样品所需的补水量,见表1。

调水斩拌后的鱼糜样品在凝胶劣化最适温度下进行二段式加热,4℃过夜冷藏后测其质构。添加效果的对比结果如图3所示。

图3 相同水分含量不同食源性物料添加效果对比Fig. 3 Effects of different foodborne materials added at same moisture content

由图3可见,添加了鱼籽的鱼糜凝胶强度高于空白样品,添加黄糠的样品凝胶强度最低。稻米来源三种结构的粉末状物料中,黄糠的油脂含量最高,而大米粉的主要成分为淀粉、几乎不含油脂。实验中发现,添加了黄糠的鱼糜样品在放置过程中有水分渗出的现象,分析其原因可能是油脂不能对结构的致密性及持水能力起到促进作用,从而导致了水分的渗出。刘海梅[31]等人的研究证明了擂溃工艺中添加淀粉可提高凝胶体的弹性系数,具有一定的“填料作用”,同时增加了干物质的含量。这与图3中的实验结果相符,故添加了黄糠、白糠、大米粉的鱼糜样品凝胶强度有所不同,样品中淀粉含量的差异可能为主导因素。

相比水分含量较低的固体粉末状添加物,胡萝卜和番茄匀浆的含水量与鱼糜本身的含水量更为接近且加入匀浆物料后的样品质地均匀,添加胡萝卜的样品凝胶强度略高于添加番茄的样品,但均未表现出良好的凝胶劣化抑制作用。分析原因一方面为胡萝卜和番茄中本身不存在具有抑制内源性蛋白酶活的物质;另一方面为具有抑制作用的物质经调水后相对浓度较低,未表现出明显的抑制效果。

2.4冻干食源性物料对鱼糜凝胶强度的影响

为了排除外源性添水对物料中有效物质产生稀释作用的可能,进一步探究番茄、胡萝卜及鱼籽中是否存在可以抑制凝胶劣化作用的物质。依照1. 2. 4中的方法对番茄、胡萝卜、鱼籽进行冻干处理,根据1. 2. 6中的方法测定样品的持水率并按照公式(2)计算。由于冻干后样品的水分含量低、各样品间差异小,且较少的添加量对鱼糜样品最终水分含量影响甚微。故不需调节水分含量,直接将冻干样品磨成粉末后按照鱼糜总量的1%添加,灌肠后测其凝胶强度及破断力。测定结果如图4所示,持水率如图5所示。

图4 冻干物料添加效果的对比图Fig. 4 Effects of different Freeze - dried materials added

图5 含冻干物料鱼糜的持水能力柱状图Fig. 5 The water - holding capacity of silver carp surimi with Freeze - dried materials

由图4可知,冻干番茄、胡萝卜和鱼籽可使鱼糜凝胶强度和破断力提高,且添加冻干物料后样品的持水率与凝胶强度呈正相关,进一步说明了持水能力可从表观上反映凝胶强度的大小。由于番茄、胡萝卜的冻干粉末可起到一定的“添料”作用,使得凝胶网络结构更加致密,切面均匀、气孔减少。故其凝胶强度及持水能力均有所提升。且由于胡萝卜的纤维含量相对较高,故添加效果较番茄更为明显。赵勇娟[32]等发现添加4%及6%烘干芹菜、洋葱蔬菜粉可提高鱼糜凝胶强度,改善质构特性。而在400g鱼糜中添加4g冻干鱼籽可使破断力提高13. 17%,凝胶强度提高10. 26%,与上文中新鲜鱼籽匀浆的添加效果相符。通过以上的实验结果可进一步证实鱼籽中确实存在以SPI为代表的一种或多种蛋白酶抑制物,可有效改善鱼糜制品的凝胶特性。本文针对鱼籽的最佳添加量及添加形式做了进一步的研究。

2.5鱼籽添加量对凝胶强度的影响

2. 5. 1 新鲜鱼籽的添加效果研究 考虑到添加成本,在混合斩拌过程中分别添加鱼糜质量1%以下的新鲜鱼籽匀浆,进行低浓度梯度实验。添加效果与空白样品的对比结果如图6所示。

图6 不同浓度新鲜鱼籽的添加效果Fig. 6 Breaking force and deformation of modori gel from silver carp added with fresh fish roe at different levels

从图6可见,添加新鲜鱼籽后鱼糜的凝胶强度及破断力均有所提高。在添加量为鱼糜质量的0. 5%时达到最大值,与空白样品相比凝胶强度提高了27. 97%。分析其原因可能为固定含量的鱼糜样品中所含的内源性蛋白酶含量一定,当添加的新鲜鱼籽中SPI的抑制效果达到饱和后,多余的样品并未起到继续提高凝胶强度的作用。这与Tanaji Kudre[26]等在研究不同添加量的黑豆分离蛋白(BBPI)和绿豆分离蛋白(MBPI)对沙丁鱼糜凝胶劣化作用的抑制效果实验得出的结论相似。实验证明添加BBPI和MBPI至1g100g-1(p<0. 05)时,凝胶化和凝胶劣化过程中TCA可溶性活性肽含量减少至最低。说明BBPI和MBPI具有抑制效果,一定添加范围可抑制肌肉蛋白的降解,当BBPI和MBPI的添加量大于1g100g-1(p>0. 05)时,不会降低TCA可溶性活性肽含量,所以继续添加BBPI和MBPI不会进一步抑制凝胶劣化。

2. 5. 2 冻干鱼籽的添加效果研究 由于新鲜鱼籽易腐败,不便工业化贮藏生产。故将新鲜鱼籽冷冻干燥后研磨至粉末,进行鱼糜质量1%以下添加效果的梯度实验。凝胶强度测定结果如图7所示。

图7 不同冻干鱼籽添加量对鱼糜凝胶强度的影响Fig. 7 Breaking force and deformation of modori gel from silver carp added with Freeze - dried fish roe at different levels

由图7可知,不同含量冻干鱼籽的添加均可使鱼糜样品的凝胶强度有所提高。图7中添加了冻干鱼籽的鱼糜与图6中添加新鲜鱼籽的鱼糜凝胶强度及破断力呈现了相似的变化趋势,且均在0. 5%的添加量处有最大值。由于鱼籽经冻干处理后,水分含量大大降低,相同质量条件下冻干样品中的抑制物浓度应大于新鲜鱼籽,但对比图6与图7可知,相同添加量的新鲜与冻干鱼籽样品,前者具有更好的添加效果。分析原因可能为,冻干过程使鱼籽中有效成分(即蛋白酶抑制物)的结构遭到了部分破坏,与冻干后样品中抑制物浓度提高的作用相抵消,最终呈现了与新鲜鱼籽相似的添加效果。

3 结论

3.1温度梯度实验结果表明,60℃为白鲢鱼糜凝胶劣化的最适温度,在60℃ 30min ～ 90℃ 20min的二段式加热条件下,水分含量的变化对鱼糜凝胶强度有较大影响,当总水分含量超过81%时下降趋势明显增加。

3.2添加1%(w/w)冻干番茄、胡萝卜、鱼籽的样品,凝胶强度和破断力均有所提高,各样品的持水率与凝胶强度呈正相关。

3.3在通过外源性添水和添加冻干物料以控制样品总水分含量的复配实验中,鱼籽的添加均可不同程度地提高鱼糜的破断力和凝胶强度,推测鱼籽中可能含有一种或多种抑制内源性蛋白酶活的物质。

3.4鱼籽作为一种营养丰富的食源性物料,在添加量极少的情况下能够明显改善鱼糜的凝胶强度,0. 5%(w/w)新鲜鱼籽的添加可使鱼糜制品凝胶强度提高27. 97%。冷冻干燥过程中,蛋白酶抑制物的部分结构可能受到了影响,但有效成分仍具有较高活性,具体作用机理尚待进一步研究。

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