6种无机絮凝剂对布朗葡萄藻的絮凝效应

郭婷婷，娄永江

(宁波大学 海洋学院, 浙江 宁波 315211)

布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii，俗称油藻)，是一种适应性较强的单细胞绿色微藻，大小在30～500 μm左右[1,2]。布朗葡萄藻富含胞外多糖、维生素和多不饱和脂肪酸等物质，有较强的产烃能力，其产烃量最高可达细胞干重的86%，远远高于其它微生物的产烃量(几乎都低于1%)，在食品生产和水产养殖中应用较为广泛，是近年在保健食品生产及鱼、虾育苗等领域应用较佳的经济藻类[3-7]。布朗葡萄藻作为二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等高度不饱和脂肪酸和可再生、无毒的生物质液体燃料的新来源日益受到国内外科研工作者的重视[8,9]。目前由于布朗葡萄藻采收困难，导致其生物质采收费用要远大于其养殖的费用[7,10]，已严重阻碍布朗葡萄藻产业的发展，因此研究布朗葡萄藻的沉降及采收具有较大的价值。无机絮凝剂絮凝沉降法具有高效、易控制、廉价等优点，在微藻的采收上应用广泛。林喆、黄振英[7,10]等研究表明通过无机絮凝剂可以在保持藻体的活性下使藻类沉淀，从而达到浓缩的效果，便于采收。而关于无机絮凝剂对布朗葡萄藻的絮凝效应的研究未见报道。为此，本文采用单因子试验方法，研究了不同浓度的硫酸铝、硫酸铝铵、硫酸铝钾、硫酸镁、硫酸铁、氯化铁对布朗葡萄藻絮凝效果的影响，旨在确定其絮凝最佳无机絮凝剂及浓度，以期为布朗葡萄藻的采收提供理论依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用布朗葡萄藻由宁波大学生物饵料培养实验室提供。用于微藻培养的海水均经脱脂棉过滤、煮沸消毒，采用MAV[11]培养液。培养条件：温度(25±1)℃，自然光照，不充气培养15～30 d。

1.2 方法

1.2.1 布朗葡萄藻测定波长确定

采用光谱扫描法[12, 13]。选取同一批不同细胞密度的藻液，以MAV培养液作为空白对照，在620～700 nm间每隔5 nm进行光谱扫描，绘制吸收曲线，选择吸光值较高且平稳的波长为其测定波长。

1.2.2 布朗葡萄藻细胞密度标准曲线绘制

采用光密度法[12, 13]，以细胞密度表征布朗葡萄藻的生物量。配制不同细胞密度的布朗葡萄藻藻液，采用血球计数板法[14]测定布朗葡萄藻藻液的细胞密度。最佳测定波长下测定不同细胞密度藻液的吸光值，绘制吸光值与细胞密度的标准曲线。

1.2.3 无机试剂絮凝效应测定

以沉降高度和沉降率表征絮凝效应，设不同浓度的硫酸铝、硫酸铝铵、硫酸铝钾、硫酸镁、氯化铁和硫酸铁溶液。藻液pH值为8的条件下，将6种无机絮凝剂分别添加到75 mL(容器半径为1.3 cm，最高高度为14.4 cm)布朗葡萄藻藻液中进行絮凝试验。藻液初始细胞密度为ρ0(万个/mL)，初始藻液高度h0(cm)。在10、25、40、60、120 min时测量沉降后下层藻液高度h1(cm)，计算沉降高度h沉降(cm)；在40、60、120 min时记录上清藻液OD680，根据1.2.2所绘标准曲线计算上清藻液细胞密度ρ1(万个/mL)，计算其沉降率P沉降(%)；沉降高度和沉降率计算公式如下：

h沉降=h0-h1

(1)

P沉降=(ρ0-ρ1)/ρ0×100

(2)

2 结果与讨论

2.1 布朗葡萄藻测定波长确定

图1为不同细胞密度布朗葡萄藻藻液的光谱扫描结果。在试验设定的不同波长中，所测得的不同细胞密度的藻液均在680 nm±5 nm处存在相对较大且平稳吸收峰，与黄美玲[12]等报告的小球藻及沈萍萍[13]等报告的15种微藻的最佳测定波长相同，最佳测定波长与其色素种类组成及含量有关，说明布朗葡萄藻与大部分微藻含有相似的色素。为此，以OD680表征布朗葡萄藻的吸光值。

图1 不同细胞密度布朗葡萄藻光谱扫描图

2.2 680 nm条件下吸光值与细胞密度之间的关系

同一批不同细胞密度的布朗葡萄藻藻液，血球计数板计数法(n=5)测定细胞密度，采用光密度法，绘制吸光值与藻细胞密度之间的吸收曲线。图2表明，在680 nm的波长下，吸光值与细胞密度线性相关度达R2=0.9918，可用OD680表征布朗葡萄藻的细胞密度。

图2 680 nm波长下藻液吸光值与细胞密度标准曲线

2.3 无机絮凝剂絮凝效应

2.3.1 絮凝效应的表征及絮凝时间

实验发现，沉降高度反映沉降后布朗葡萄藻藻液含水量，即富集度，沉降高度越高，富集度越好；沉降率反应沉降后布朗葡萄藻的得率，沉降率越高，得率越高；因此以沉降高度和沉降率综合表征絮凝效应。同时布朗葡萄藻经6种无机絮凝剂絮凝处理，60 min后沉降高度和沉降率趋于稳定，以60 min絮凝处理后的沉降高度、沉降率表征6种无机试剂对布朗葡萄藻的絮凝效应。

2.3.2 铝(Ⅲ)盐絮凝效应

从图3(a)中可以看出，随着硫酸铝添加量的增加，沉降高度呈现上升趋势，但在60 min后并无显著差异(P>0.05)。藻液在絮凝60 min后，不同浓度的硫酸铝的沉降高度在11.88～12.24 cm之间(P>0.05)；从图3(b)中可以看出，硫酸铝对藻液的沉降率在絮凝60 min后趋于稳定，不同浓度的硫酸铝对藻液的沉降率有显著差异(P<0.05)，当添加量为1.1 g/L时出现最大值为91.2%。

从图4(a)絮凝结果可以看出，硫酸铝铵的添加量在0.5～0.7 g/L时，不同浓度的硫酸铝铵对沉降高度的影响并不显著(P>0.05)。沉降60 min藻液稳定后，硫酸铝铵的添加量为1.1 g/L时，沉降高度出现最大值为12.42 cm。但是，当硫酸铝铵浓度大于0.7 g/L时，藻体部分死亡变白，硫酸铝铵浓度大于1.2 g/L时，藻体全部死亡。因此硫酸铝铵的最适添加量应为0.5 g/L，絮凝60 min后沉降高度为12.06 cm，沉降率为83.2%(图4b)。

不同浓度的硫酸铝钾对藻液的沉降高度及沉降率有显著差异(P<0.05)，藻液的沉降高度和沉降率随硫酸铝钾浓度的增加呈现上升趋势(图5)。从图中可以看出，沉降60 min后，沉降高度与沉降率趋于稳定，此时藻液的沉降高度最大为12.06 cm(图5a)，沉降率为93.5%(图5b)。硫酸铝钾浓度大于0.5 g/L时，藻体部分死亡变白，因此硫酸铝钾的添加量应小于0.5 g/L。在添加量为0.45 g/L，沉降60 min后，藻液的沉降高度为10.08 cm，沉降率为93.5%。

3种铝(Ⅲ)盐对布朗葡萄藻的絮凝效应不同，是由于在pH值为8条件下3种盐中的铝离子强度的不同，离子强度越强，铝离子对细胞壁上多糖的络合力就越强，吸附效率越高，絮凝效应越好[15,16]；高浓度硫酸铝铵对布朗葡萄藻之所以有致死作用，主要是铵离子对藻体有胁迫作用，抑制丛粒藻烯的合成，后期造成不可逆的毒害作用[17]；而硫酸铝钾其本身有一定毒性，需在食品和藻类中慎加，对布朗葡萄藻藻体的细胞壁有不可逆的毒害作用，易造成藻体死亡。

图3 不同浓度硫酸铝对布朗葡萄藻的絮凝效应

图4 不同浓度硫酸铝铵对布朗葡萄藻的絮凝效应

图5 不同浓度硫酸铝钾对布朗葡萄藻的絮凝效应

2.3.3 镁(Ⅱ)盐絮凝效应

从图6(a)中可以得出，随着硫酸镁添加量的增加，藻液沉降高度呈显著的上升趋势(P<0.05)，在絮凝时间高于60 min后，沉降高度趋于稳定。对于沉降率(图6b)，有相同的趋势。但是，硫酸镁浓度≥1.0 g/L时，藻体部分死亡变白，硫酸镁浓度≥1.3 g/L时，藻体全部死亡。因此，硫酸镁对藻液絮凝作用的最适添加量为0.8～0.9 g/L，沉降高度和沉降率分别为10.80 cm和81.0%。

高浓度的硫酸镁溶液之所以对布朗葡萄藻有致死作用，主要是因为镁离子对布朗葡萄藻有胁迫作用[18]，易引起布朗葡萄藻死亡变白。

图6 不同浓度硫酸镁对布朗葡萄藻的絮凝效应

2.3.4 铁(Ⅲ)盐絮凝效应

以硫酸铁为絮凝剂对布朗葡萄藻的絮凝作用见图7。从图7(a)中可以看出，随着添加量的增大，藻液的沉降高度呈显著变化(P<0.05)。60 min后，硫酸铁的添加量为1.2 g/L时，有最高的沉降高度为10.8 cm，此时藻液的沉降率为47.9%(图7b)；对于藻液的沉降率，在整个絮凝过程中随硫酸铁的添加量的增加呈显著的上升趋势(P<0.05)，硫酸铁的添加量为1.4 g/L时，其最大值为65%(图7b)。

图8为不同浓度的氯化铁对布朗葡萄藻絮凝效应的影响。藻液的沉降高度随絮凝时间增加显著的上升(P<0.05)，在60 min后趋于稳定(图8a)；在絮凝剂的添加量高于0.7 g/L后，絮凝高度有明显的上升过程；从氯化铁对其絮凝结果中可以看出(图8b)，絮凝剂的浓度对沉降率并无显著作用(P>0.05)，并且在絮凝60 min后趋于稳定。添加量为0.9 g/L时，藻液的沉降高度和沉降率达到最大值，分别为10.62 cm、88.0%。

两种铁(Ⅲ)对布朗葡萄藻絮凝效应的差异，主要是因为在碱性条件下两种铁盐的离子强度：氯化铁>硫酸铁，氯化铁更易与藻体形成絮凝而沉降[15，16]。

图7 不同浓度硫酸铁对布朗葡萄藻的絮凝效应

图8 不同浓度氯化铁对布朗葡萄藻的絮凝效应

3 结论

本研究采用光密度法测定布朗葡萄藻的生物量，确定了布朗葡萄藻的最佳测定波长为680 nm，得出了OD680与藻液细胞密度的相关性标准曲线，说明光密度测定生物量的可行性，以此间接测定布朗葡萄藻的絮凝效应。

根据絮凝单因素试验，发现6种无机试剂对布朗葡萄藻均有明显的絮凝效应，但硫酸铝铵、硫酸铝钾、硫酸镁超过一定添加量会造成藻体死亡；同时发现硫酸铝、硫酸铝钾、氯化铁3种无机试剂的絮凝效果较其它3种无机试剂明显；根据试验得出：絮凝时间控制在60 min；硫酸铝浓度控制在1.1 g/L，沉降高度为12.24 cm，沉降率为91.2%；硫酸铝钾浓度控制在0.45 g/L以内，沉降高度为10.08 cm，沉降率为93.5%；氯化铁浓度控制在0.9 g/L，沉降高度为10.62 cm，沉降率为88.0%。

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