GCRV及其细胞灭活苗对草鱼4种酶活性的影响

袁雪梅, 沈锦玉, 蔺凌云, 潘晓艺, 姚嘉赟, 徐 洋, 尹文林, 郝贵杰，2

(1. 浙江省淡水水产研究所，浙江 湖州 313001； 2. 宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211)

草鱼是中国淡水养殖四大家鱼之一，在其养殖过程中疾病频发成为阻碍草鱼养殖规模化发展的瓶颈。在所有病原中，以草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus, GCRV)危害最大，导致损失严重。草鱼出血病是一种高传染性、高致死性的病毒性疾病，是中国淡水水产养殖中最为突出的问题之一[1，2]。

鱼类的免疫体系包括特异性免疫和非特异性免疫，在感染各种病原体初期，抗体尚未形成，主要靠非特异性免疫发挥功能。非特异性免疫受许多环境因子影响，温度、摄食状况、拥挤等因子国内外已有很多报道[3]，对病原微生物感染后鱼体的变化研究多从病理学及激活抗原-抗体反应的特异性免疫的角度进行，较少有考察感染病原微生物对鱼类感染初期非特异性免疫功能方面的报道。本文以不同浓度的草鱼呼肠孤病毒通过腹腔注射感染草鱼，同时用草鱼呼肠孤病毒细胞灭活苗免疫草鱼，然后于不同时间取血及肝脏，通过测定酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活力变化趋势来研究病毒感染及疫苗免疫对草鱼非特异性免疫功能的影响。以期为鱼类在感染病原微生物以及免疫疫苗后的非特异性免疫响应研究提供可借鉴的手段，在鱼类的抗病分析、疾病预报等方面提供应用前景。

1 材料和方法

1.1 病毒、细胞及实验鱼

草鱼呼肠孤病毒(JX2008)由本实验室分离保存。草鱼肾细胞系(CIK)由本实验室传代保存。用于本研究的草鱼购自浙江省淡水水产研究所苗种基地，体重为10～15 g，分别置于4个体积约为300 L自动充气水循环系统圆柱形水缸中饲养, 每缸放40尾，饲养2周，水温保持( 26±1)℃，试验期间每天投喂颗粒性饵料2次，投饵之前先吸污换水。

1.2 病毒培养、细胞苗制备及免疫注射

将保存于液氮中的JX2008病毒接种于长成致密单层的CIK细胞，室温下吸附1～2 h, 吸弃病毒液，加入与培养液等量的维持液(含3%FBS的DMEM)，28℃恒温培养。每日观察细胞形态，直至出现80%细胞病变，收取病毒液进行滴度测定。病毒滴度按常规方法[4]进行测定。将滴定好的病毒与甲醛溶液混合，甲醛的终浓度为0.2%，于28℃温育72 h。然后接种于长成致密单层的CIK细胞，观察是否有细胞病变。

3组实验鱼用MS222溶液(1 mg/L)麻醉，第1组G1为高浓度感染组，每尾草鱼经腹腔注射TCID50为1×106的草鱼呼肠孤病毒0.1 mL，第2组G2为低浓度感染组，每尾草鱼注射TCID50为1×103的草鱼呼肠孤病毒0.1 mL，第3组G3为疫苗组，每尾草鱼注射细胞灭活疫苗0.1 mL，第4组G4为每尾注射同等剂量的灭菌生理盐水作为对照。

1.3 样本采集

分别在实验开始的第1、2、7和14 d取样，每组随机选取4尾实验鱼。实验鱼用MS222(1 mg/L)深度麻醉，尾静脉采血1.0 mL。室温静置待其凝固，4℃冰箱静置过夜，4000 r/min离心10 min，收集上层血清，用于ACP、AKP、MPO、SOD活性的测定。同时迅速剥离肝脏组织，滤纸吸干水分后称重，加入无菌生理盐水于冰浴中匀浆，使浓度达到0.1 g/mL，在4℃条件下，以3000 r/min离心10 min，除去沉淀后获得草鱼的肝脏组织提取液，并以其作为酶原液进行酶活性测定，置于4℃冰箱中备用。

1.4 酶活力测定

组织蛋白含量的测定和ACP、AKP、SOD、MPO活力的测定，均采用南京建成生物公司提供的检测试剂盒，相应操作参照说明书进行。各组织中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。ACP及AKP活力测定均采用磷酸苯二钠法。ACP活力单位定义为每克组织蛋白(或100 cm3血清)在37℃与基质作用30 min产生1 mg酚为1个活力单位(U/g或10-2U/cm3)。AKP活力单位定义为每克组织蛋白(或100 cm3血清)在37℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个活力单位(U/g或10-2U/cm3)。SOD活力采用黄嘌呤氧化酶法测定，活力单位定义为1 mg组织蛋白在1 cm3反应液(或1 cm3血清)中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活力单位(103U/g或U/cm3)。MPO活力采用过氧化氢还原法测定，活力单位定义为每克组织湿片在37℃的反应体系中H2O2被分解1 μmol为1个酶活力单位。

1.5 数据分析

所有数值均为平均值±标准差。各处理组与对照组之间各项免疫指标的差异用SPSS软件(16.0)中的单向方差分析法(ANOVA)进行分析，P<0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 酸性磷酸酶活力

不同处理组草鱼在1、2、7、14 d血清中酸性磷酸酶活性结果见图1。试验结果表明G1、G2组及G3组在各个时间点酸性磷酸酶活性有所变化，但是较对照组的差异均不显著。不同处理组草鱼在1、2、7、14 d肝脏中酸性磷酸酶活性结果见图2，各组肝脏中酸性磷酸酶活力大体呈现先降低后升高的趋势，其中G1组在第2 d极显著低于对照组，第14 d时显著高于对照组；G2组在第1 d时显著低于对照组；G3组在第1、14 d时显著高于对照组，第7 d时显著低于对照组。

图1 不同处理组草鱼血清中酸性磷酸酶活力的变化情况

注：*表示该组与对照组差异显著(P< 0.05)；**表示该组与对照组差异极显著(P< 0.01)，下同。

图2 不同处理组草鱼肝脏中酸性磷酸酶活力的变化情况Fig 2 The change of ACP activity in grass carp liver in different treatment groups

2.2 不同处理组草鱼血清及肝脏提取液中碱性磷酸酶活力

不同处理组草鱼在1、2、7、14 d血清中碱性磷酸酶活性结果见图3。试验结果表明G1组碱性磷酸酶活力呈现先升高后降低的趋势，在第7 d时达到最高值，极显著高于对照组，到第14天时极显著低于对照组；G2组碱性磷酸酶活力呈现持续升高的趋势，在第7 d时，极显著高于对照组，到第14 d时，显著低于对照组；G3组呈现升高的趋势，在第2、7 d时显著高于对照组，到第14 d时显著低于对照组。

不同处理组草鱼在1、2、7、14 d肝脏中的碱性磷酸酶变化情况如图4所示，G1、G2组碱性磷酸酶均呈现先降低再升高再降低的趋势，其中G1组在第1、7 d时极显著高于对照组，到第14 d时极显著低于对照组；G2组在第1、2、7 d时均极显著高于对照组，在第14 d时极显著低于对照组；G3碱性磷酸酶活力呈现先升高再降低的趋势，在第1、14 d时极显著低于对照组，在第2、7 d时极显著高于对照组。

图3 不同处理组草鱼血清中碱性磷酸酶活力的变化情况Fig 3 The change of AKP activity in grass carp serum in different treatment groups/d

图4 不同处理组草鱼肝脏中碱性磷酸酶活力的变化情况Fig 4 The change of AKP activity in grass carp liver in different treatment groups

2.3 不同处理组草鱼血清及肝脏提取液中髓过氧化物酶活力

不同处理组草鱼在1、2、7、14 d血清中髓过氧化物酶活性结果见图5。试验结果表明3个处理组的变化趋势不尽相同。其中G1组髓过氧化物酶活性呈上升趋势，与对照组相比，在第1 d时极显著低于对照组，第2 d时显著低于对照组；G2组呈先升高再下降的趋势，与对照组相比，在第2 d时极显著高于对照组；G3组呈现升高降低再升高的趋势，与对照组比较，在第1、2 d时极显著高于对照组，第7 d时显著低于对照组。

不同处理组草鱼在1、2、7、14 d肝脏中髓过氧化物酶活性结果见图6，G1组髓过氧化物酶活性呈现先降低再升高再降低的趋势，在第14 d时极显著低于对照组；G2、G3组均呈现先升高再降低的趋势，其中G2组在第1 d时显著低于对照组，第7、14 d时极显著低于对照组，G3组在第7 d时极显著高于对照组。

图5 不同处理组草鱼血清中髓过氧化物酶活力的变化情况Fig 5 The change of MPO activity in grass carp serum in different treatment groups

图6 不同处理组草鱼肝脏中髓过氧化物酶活力的变化情况Fig 6 The change of MPO activity in grass carp liver in different treatment groups

2.4 不同处理组草鱼血清及肝脏提取液中超氧化物歧化酶活力

不同处理组草鱼在1、2、7、14 d血清中超氧化物歧化酶活性结果见图7，G1组呈现先升高再降低的趋势，在第2 d的时候极显著高于对照组，第7 d的时候显著高于对照组，第14 d时极显著低于对照组；G2组呈现升高的趋势，第1 d时极显著低于对照组；G3组呈现先升高再降低再升高的趋势，在第2、7 d时均极显著高于对照组。

图7 不同处理组草鱼血清中超氧化物歧化酶活力的变化情况Fig 7 The change of SOD activity in grass carp serum in different treatment groups

不同处理组草鱼在1、2、7、14 d肝脏中超氧化物歧化酶活性结果见图8。结果显示，G1组的先升高后降低的趋势，与对照组比较，第1、2 d均显著高于对照组，第7 d时极显著高于对照组，第14 d显著低于对照组；G2组呈现降低的趋势，与对照组比较，第1、2、7 d均显著高于对照组，第14 d时极显著低于对照组；G3组呈现先降低后升高的趋势，但与对照组相比差异不明显。

图8 不同处理组草鱼肝脏中超氧化物歧化酶活力的变化情况Fig 8 The change of SOD activity in grass carp liver in different treatment groups

3 讨论

3.1 ACP作为溶酶体酶的重要组成部分，在鱼类等低等脊椎动物及软体动物中，保证了溶酶体有效完成防御和消化的双重功能。ACP活性程度可以判定巨噬细胞激活程度，同时反映机体的免疫机能状况。郭伟荣等[5]发现鳗弧菌感染使花鲈血清中ACP活性显著升高，证明花鲈的巨噬细胞被激活，抗应激水平提升，增强了花鲈对病原微生物的抵御能力。马骞等[6]用哈维氏弧菌感染条纹斑竹鲨后，其组织及血清中ACP总体呈现先抑制后诱导的趋势，表明条纹斑竹鲨在感染哈维氏弧菌后，体内的吞噬作用开始受到抑制而后逐渐恢复并被大量激活。在本实验中，各处理组草鱼肝脏中ACP活力呈现先降低后升高的趋势，提示体内的吞噬作用先受到抑制而后被激活，血清中ACP的活性均小于肝脏中ACP的活性，这与其它水产动物及高等脊椎动物ACP在不同组织中分布情况相同[7]。已有研究表明，应激对鱼类的非特异性免疫细胞具有抑制作用, 造成吞噬细胞的吞噬能力降低[8]。本实验中各处理组血清中ACP的活性有所变化，但是与对照组的差异均不显著，可能是由于鱼体的应激抑制了吞噬作用，伴随吞噬作用而释放的水解酶并未被大量激活所致，但还需进一步证实。

3.2 AKP主要分布于机体的肝脏，在正常情况下这些血清酶活性低且相对稳定，是血细胞溶酶体的特征酶，会对异物产生水解破坏作用[9]。陈寅儿等[10]和郭伟荣等[5]证明鲈鱼及花鲈在受到细菌感染后血清中AKP的含量上升。在本实验中各处理组草鱼血清中的AKP均有上升趋势，这一结果与前两位研究结果相似。在第7 d的时候3个处理组活性均极显著高于对照组，其中G1组活性最大，说明AKP活性与刺激物浓度有一定关系。

3.3 MPO是动物体内参与免疫防御的重要氧化酶之一[11,12]，和H2O2和卤化物组成了抗细菌及其它微生物体系，在非特异性免疫中发挥极为重要的作用。髓过氧化物酶催化过氧化氢和氯化物反应生成次氯酸盐，后者可以与胺盐反应生成氯胺，在它的作用下使机体快速、强烈的杀灭微生物[5,13]。孙虎山等[11]发现免疫促进剂及可促进栉孔扇贝血细胞中MPO的生产及向血清中释放,免疫多糖可增强栉孔扇贝血淋巴MPO活性，王宜艳等[12]发现中国对虾口服复合免疫药物后，血清中MPO活力明显增高。王江勇等[14]发现杂色鲍感染病毒能促进MPO在血细胞的产生并逐渐释放进血清中。本实验中，各处理组血清和肝脏中MPO活性大体呈现先上升再下降的趋势，说明刺激物进入鱼体能促使MPO的产生和释放，随着时间的增长，MPO活性受到抑制。

3.4 SOD能专一地清除体内有害的自由基，以解除自由基氧化体内的某些组分而造成的机体损害。关于水产动物组织中SOD酶活性受有关物质影响的实验所得结论不一致[7, 15-17]。郭伟荣等[5]用鳗弧菌感染花鲈后，实验组SOD活性与对照组比较无显著差异，表明花鲈对鳗弧菌的体内吞噬作用抑制和消除了自由基的形成，使SOD的活性变化不明显，可以保持细胞免受损害，从而维护细胞的正常结构和功能。本实验中3个处理组SOD活性变化不尽相同，G1组无论血清还是肝脏中活性均呈现先上升再下降的趋势，分析其原因可能是感染初期机体内吞噬作用产生活性氧，在活性氧诱导下SOD活力提高，此后SOD活力下降可能是随着感染时间增长，体内吞噬作用的进一步恢复并增强机体产生大量的活性氧, 但SOD清除活性氧的能力有限,同时鱼体内的氧化酶反应系统需要通过协调各种酶的变化以抵抗活性氧对机体的伤害，因此SOD活力受到抑制。G2组血清呈现上升趋势，肝脏呈现下降趋势，G3组血清呈现先上升再下降再上升的趋势，肝脏呈现先下降再上升的趋势，两个处理组血清和肝脏中SOD活性变化趋势均相反，但是这两个组织中SOD活性总和除了第7 d趋于稳定，表明体内SOD活性维持一个动态平衡。

3.5 本文中所用的GCRV为弱毒株，高低浓度均未使草鱼发病，剖检内脏未见明显病变，从免疫学角度可以说明GCRV进入鱼体起到弱毒疫苗的作用，文中高、低浓度GCRV及其细胞灭活苗对4种酶活影响不同说明疫苗的种类和疫苗的剂量都会对机体非特异性免疫应答产生影响。

在养殖草鱼的病害防治过程中，化学药物和抗生素的使用对环境和食品安全存在着潜在的危害，这对水产病害防治技术研究提出了更高的要求，免疫防治成为目前研究的热点之一，因此对草鱼非特异性防御体系的认识是非常必要的。本文着重从非特异性免疫的角度讨论了病毒感染和疫苗免疫后，鱼类非特异性免疫体系所做出的反应，为鱼类在感染病原微生物以及免疫疫苗后的非特异性免疫响应研究提供参考。

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