动物microRNA研究现状

王娇娇，王泽英，罗光彬，白文林

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866）

microRNA是一类长度约22nt的内源性非编码小RNA分子［1］，它能够通过与靶基因3′非翻译区结合从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因。首个miRNA lin-4是在线虫时序性发育调控的研究中被发现，但7年后let-7的发现，才使miRNA研究拉开了序幕。目前，在动植物及病毒中已经发现4 361个miRNA分子，大多数以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中，人类细胞中大概有200种不同的miRNA。miRNA参与复杂的生物学过程，如早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢等，调控众多的靶基因器官，在生物体内分布广泛，近年来，miRNA已经成为分子生物学领域研究的热点之一。本文就microRNA参与动物生长和发育﹑脂质代谢的调控﹑疾病预防和治疗等方面的相关研究进行概述，为进一步探索microRNA参与动物生命过程的研究提供参考。

1 microRNA的生物合成与特性

microRNA的生物合成及作用受到很多学者们的关注与研究。Rodriguez A等为了更清晰的了解动物microRNA的转录，对非编码RNA的基因组位置和它的上、下游结构分别在人类和鼠中进行了研究，发现人和鼠的microRNA是重叠基因并且分别来自编码蛋白质基因的内含子或RNA的外显子和内含子，由此表明microRNA的转录是与它们宿主转录并列的。如图1所示在动物中，microRNA 的合成大致可以分为在细胞核内和细胞质内两个阶段：①在细胞核内，首先编码转录microRNA的基因由多聚酶Ⅱ转录生成pri-microRNA，pri-microRNA被核内RNaseⅢ核酸酶Drosha等一些成分构成的微处理器（microprocessor）复合体加工成发夹结构长度约55～70nt的pre-microRNA，然后在Exportin5和G蛋白因子Ran的帮助下pre-microRNA就从核进入到了胞质内；②在细胞质内，pre-microRNA在Dicer酶与结合蛋白的作用下被切割成21nt～25nt的双链microRNA分子，然后microRNA分子被解链，其中一条降解，另一条则为成熟的单链microRNA，单链microRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP（也叫RNA诱导的基因沉默复合物RISC），microRNA与靶基因的3′UTR区互补配对，从而实现指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或翻译抑制。

microRNA有一些主要特征：与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段有所区别，成熟microRNA的5′端为磷酸基团，3′端为羟基，microRNA 5′末端Watson-Crick 2-8个碱基配对核苷酸是它与靶mRNA特异性互补结合的主要决定因素，叫作“种子序列”。其他区域的核苷酸环绕mRNA 3′UTR序列成二级结构，也会抑制mRNA作用。microRNA的作用模式还与它和靶基因的互补程度有关，当二者完全互补时切割靶mRNA，当不完全互补时，抑制靶蛋白翻译，当然也存在两种模式结合的情况。microRNA是一组不编码蛋白质自身不具备开放阅读框架的短序列RNA，在真核生物中广泛存在。另外，从同一个前体RNA加工得来的共表达miRNA存在基因簇现象，而且簇生排列的基因通常是协同表达。microRNA在进化上具有高度保守性，表达上具备严格的时空性和组织特异性，且在不同生物体间行使相同的功能。

2 肌肉发育相关的miRNA

脊椎动物肌肉的生长主要依赖于肌纤维的增殖和肥大，即肌纤维的数量和大小。胚胎期肌细胞经反复的有丝分裂，大量增殖。出生后动物肌纤维的数目不再增加，此后肌纤维的生长主要依赖于体积的增加和肌纤维的增长［3］。目前，关于肌肉发育的机制还不很清楚，但是在肌细胞的增殖、分化过程中许多调节因子都发挥着重要作用，近年来发现microRNA也在其中发挥重要的调节作用，下面就近几年来研究比较多的microRNA做以介绍。

在肌肉中特异表达的miRNA包括miR-1、miR-133a、miR-206、miR-208a、miR-208b等，统一命名为myomiR家族［4］。在小鼠 miR-1、miR-133a所在的染色体上，microRNA基因簇上游增强子处均发现有生长激素释放因子（somatotropin releasing factor，SRF）结合位点，在两种基因内部也有myoD和SRF结合位点。并有研究表明当小鼠心脏内部缺失SRF后，miR-1、miR-133a的表达水平也随之呈现下调状态。在C2C12成肌细胞中，miR-1过表达会增加肌源细胞的分化和多核成熟肌管的形成，从而证明miR-1的作用是促进肌细胞的分化。2006年Chen JF等研究发现在骨骼肌细胞分化成熟过程中miR-1和mir-133呈现一定的时空特异性表达，其中miR-1促进肌细胞分化，而mir-133则抑制分化而促进成肌细胞增殖，结果显示了两者对于骨骼肌的发育均存在显著的调节作用。miR-133主要通过抑制SRF的表达来行驶功能，而SRF又是可以启动miR-1和miR-133转录的转录因子，这种关系使得SRF与miR-1和miR-133之间成为一个负反馈环，调控肌肉的发育变得更加精确。由此可见，在维持肌肉的增殖和分化的动态平衡方面，miR-1和miR-133相互协调。Clop A等在绵羊2号染色体上发现了一个与肌肉生长相关的数量性状基因座，并将肌肉生长抑制素基因在此座位定位。随后通过人为使肌肉生长抑制素基因的等位基因3′末端一个G突变为A，结果发现骨骼肌miR-1和miR-206的表达明显增加。在发育期的小鼠心脏中，过表达miR-1后导致心肌细胞的增殖受阻，抑制成肌细胞增殖，而过表达miR-1后小鼠心肌细胞的表面积减少，同时还能明显减少心肌细胞ANP及βMHC（心肌肥厚标志物）的基因表达量［5］，这表明miR-1也参与心肌细胞的生长过程。同样作为myomiR家族成员的miR-206，与miR-1和miR-133不同的是它仅在脊椎动物的骨骼肌中特异表达，且在慢肌中高表达。因此，它可能在成年动物肌肉卫星细胞发育和肌纤维类型转变过程中调节基因的表达［6］。miR-206对肌肉分化的表达调控是通过转化生长因子β和肌肉生长抑制素对其抑制来实现的。在C2C12成肌细胞诱导分化成肌管的过程中，miR-206表达显著上调。miR-206在C2C12细胞中过表达时，阻滞细胞生长周期，诱导肌管生成；而miR-206表达受到抑制时，结果则相反［7］，表明它在骨骼肌分化中起着重要的调控作用。miR-208a是由α-MHC基因（Myh6）内含子编码的心脏特异性microRNA，在心肌肥厚、纤维化及调节β-肌球蛋白重链表达过程中起重要作用，从而参与心肌的应激反应。miR-208b是和miR-208作用相反的一组蛋白。因miR-208b和miR-208只有3个核苷酸不同，所以这种类型的调节使心脏中“miR-208活性”维持长久水平。另外，miR-214在猪胎儿和成年骨骼肌的表达中有差距，很有可能它会与猪胎儿肌肉发育有一定的联系。于是Feng Y等［8］对其进行了试验研究，对猪C2C12成肌细胞进行体外培养，结果表明成肌细胞和肌管中miR-214都有表达，并在肌肉分化时表达上调。而当抑制处理miR-214的表达时，发现体外培养细胞的增殖和分化都受到抑制。由此可见，miR-214在肌肉的增殖和分化上起到重要作用。

3 miRNA对脂质代谢的调控

microRNA与脂代谢密切相关，越来越多的研究表明，miRNA可以通过与脂类代谢相关基因靶位点结合在转录后水平参与调节脂肪酸和胆固醇等多个层面的脂类代谢。这些发现使人类对代谢调控有了新的认识，其中比较典型的有miR-122、miR-370、miR-33、miR-27、miR-143等 miRNA。

miR-122是肝脏里表达丰度最高的miRNA，占所有miRNA表达的70%，而肝脏又是脂蛋白代谢的重心，脂蛋白扮演着细胞内外脂类运输的重要媒介，主要是传递中性脂类，提示miR-122可能与脂蛋白代谢相关。在研究过程中，使肝脏内miR-122超表达，结果显示，多种胆固醇生物合成相关基因表达随之上调，从而引导机体内胆固醇的合成。采取反义寡核苷酸（antisense ASO）特异阻断miR-122，发现多种脂肪酸和胆固醇合成相关基因表达显著下降。这表明miR-122对胆固醇和脂肪代谢相关的基因有影响，但并没有表现出能直接靶向生物合成途径的特性［9］。miR-370对脂代谢同样有调节作用，但试验显示其调节方式与miR-122有所不同，用miR-370和miR-122转染HepG2细胞，都能上调或下调跟脂肪酸和胆固醇合成相关的SREBP-1c、二酰基甘油酰基转移酶（DGAT2）、酰基辅酶 A 羧化酶（ACC1）、FASN 等转录调控因子［1］。Marquart T J等［11］使用反义 miR-122处理miR-370转染的HepG2细胞，miR-370调控效果明显下降，表明miR-370调节脂肪酸和胆固醇的代谢并非直接的，而是通过作用于miR-122间接发挥作用的。另外miR-370还能靶向肉碱脂酰转移酶1α（Cpt1α）的3′UTR，下调 Cpt1α的表达，使脂肪酸氧化的减少。miR-33通常位于SREBP的内含子上，SREBP本身也是是调控脂代谢的重要转录调节因子。多项研究表明，miR-33可以在转录后水平控制细胞内胆固醇动态平衡，还可以在多个层面不同途径调控脂代谢。Horie T等［12］克隆了包含 miR-33a的SREBP-2的内含子片段，试验证明，miR-33a在Srebf-2激活时表达。Rayner K J等［13］对巨噬细胞的研究证实，miR-33a在胆固醇耗尽情况下会表达上调。另有研究表明miR-33a能够强烈抑制其靶基因ATP结合盒转运蛋白1（ABCA1）在mRNA和蛋白质水平的表达［14］，进而从第一步抑制了新生高密度脂蛋白颗粒的形成。与之呼应的是，内源性miR-33的抑制会使ABCA1蛋白质表达上调胆固醇流动增加。另外两种miR-33的靶基因ABCG1能使游离胆固醇形成成熟颗粒和NPC1能使溶酶体内胆固醇向外运输。所有这些表明miR-33能够在转录后水平调节ABCA1靶基因的表达，各靶基因之间通过协同作用进而保持胆固醇动态平衡。miR-33不仅调节胆固醇的外流，还直接调节与脂肪酸氧化相关蛋白的表达，同时也调节脂肪酸和三酰甘油合成上游基因sirtuin 6（SIRT6）［15］，据上推测miR-33调节着脂肪酸氧化，同时通过抑制SIRT6的表达增加脂肪的合成。miR-33的研究表明，一种miRNA可以通过靶向于多个不同靶基因，从而调节脂代谢的多个层面，可见miRNA调节作用的精巧与复杂。miR-143与人类前脂肪细胞分化有关的研究已发表，随后Li H等［16］又分析了miR-143在哺乳动物肌间脂肪分化中的作用。试验发现体外培养的公牛前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞时miR-143的表达上调。而通过反义抑制剂作用于miR-143后，前脂肪细胞的分化也表现为抑制状态，表明miR-143对牛肌间脂肪也起到重要调控作用。后有研究进一步表明miR-143在脂肪细胞分化时，促进了甘油三酯的分解，抑制游离脂肪酸和甘油的合成，从而使脂滴沉积，促进脂质代谢。这些都表明miR-143是脂质代谢调控中的一个重要角色。而miR-27a则在猪脂肪细胞分化的过程中，抑制脂质合成促进其分解代谢，进而阻碍脂肪细胞脂滴的沉积［17］。先前有研究者发现敲除了miR-8基因后的果蝇体型明显变小，并证实miR-8基因通过与靶标基因互相作用影响胰岛素信号通路，对果蝇体型尺寸方面具有重要调控作用，而且miR-8主要作用的器官是果蝇的脂肪体。随后又有研究者对miR-8的同源基因miR-200家族，包含 miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429共五个成员在哺乳动物对体型发育的调控作用，结果显示敲出了miR-200基因家族成员的小鼠体重减轻而且原因也是脂肪量的减少［18］，但miR-200家族对脂肪细胞调控的具体机制还有待研究。

4 miRNA与疾病

研究证实，miRNA在心肌病和骨骼肌病中表达失调，甚至一个microRNA表达变化就会对某些肌肉疾病起到诱发或缓解作用。例如，在鼠类心肌肥大研究中显示，miR-195的表达上调，而原本高表达的miR-1表达明显下调，当miR-195在心脏特异启动子调控下的转基因鼠心脏中过表达时，其诱导心力衰竭和细胞死亡导致严重的心肌肥大，而阻断miR-1表达同样导致心肌肥大的发生。Zhao Y等研究显示，胎鼠心脏中miR-1过表达时能够调控β肌球蛋白重链启动子，从而抑制心肌细胞增生，13.5d后胚胎由于心肌细胞缺失而死。有研究证实，一些miRNA，例如miR-21、miR-29等参与调控心肌纤维化的过程，在心肌梗死后miR-29家族表达下调，而miR-21在心肌缺血再灌注或心力衰竭最后阶段的心肌成纤维细胞中表达上调，最终导致心肌纤维化［19］。无论是在肌营养不良小鼠的膈肌还是骨骼肌中miR-206的表达都上调。接种横纹肌肉瘤的小鼠过表达miR-206后，导致肌细胞加强分化而抑制肿瘤生长［20］，肿瘤中miR-29的表达受到抑制，而当使miR-29过表达后，肿瘤生长受抑制，提示miR-29可能作为抑癌的因子。许多研究已经发现，在动物代谢异常过程中也伴随着miRNA表达失调，例如，在肥胖小鼠的肝和白脂肪组织中，Kai Z S等［21］发现，miR-335表达上调，且证明与小鼠体重、肝和白脂肪组织重量的增加有关，也与三酰甘油以及胆固醇的含量升高有一定联系。Lin Q等人发现miR-27在脂肪分化时表现下调，而miR-27过表达时会抑制脂肪细胞形成，同时肥胖会导致一种状态，这种状态也会调控miR-27。由于miR-27a的靶基因超过300个，因此miR-27a不仅只可以调节脂质代谢还有可能调节其他生理过程。己有研究表明，miR-27b转基因小鼠经过3月龄6月龄可出现心肌肥厚并伴有心肌纤维化，另外并进一步研究了过表达miR-27b后心脏超显微结构的变化，发现3月龄小鼠无明显变化，而6月龄转基因小鼠线粒体基质变少甚至空泡，从而表明miR-27b过表达会损伤心肌线粒体［22］。心肌特异性基因miR-195对小鼠转基因后同样会出现心肌肥厚心肌纤维化，进而6月龄表现心衰，miR-208转基因小鼠也发生心肌肥厚并有心脏传导障碍现象。有研究提示miR-199b也对心肌肥厚发挥一定作用，但具体机制还有待研究。在脊椎动物中，在胰岛中表达的miR-375能够抑制胰岛素分泌，已证实miR-375的靶基因是重组胰岛素样生长因子1（Mtpn）基因，当这个靶基因被敲除后，miR-375加倍影响胰岛素分泌。miR-103也是机体中重要的microRNA，最初是在人体中克隆并鉴定出来的，随后在其他物种中也陆续检测出来了。目前已证实MiR-103参与多种生物学功能，除能调节脂质代谢外，在多种癌症组织中也表现出表达量异常，比如有学者对食管癌组织进行MiR-103表达量分析发现其明显比正常组织的表达量高。另外，miR-103还参与胰岛素敏感性的调节，miR-103/107可以调控胰岛素受体调节因子从而抑制其翻译，所以在肥胖鼠中miR-103/107明显表达上调，而抑制其表达时会使胰岛素的敏感性提高，胰岛素信号的缺失是引起二型糖尿病产生的最普遍因素，因此miR-103可作为二型糖尿病及肥胖症治疗研究的新靶点［23］。近年来，miR-199a与肿瘤和癌症关系的研究也较多，如Yu T等在口腔癌大鼠模型组织的研究发现miR-199a表达量降低。还有研究显示，无论是肝癌组织中还是肝癌细胞中miR-199a表达都有显著下调。肝癌中miR-199a的表达调控与组蛋白修饰有关而与DNA甲基化无关，这一点与其他肿瘤不同，在肺癌和睾丸肿瘤中miR-199a的表达直接与甲基化直接相关，高甲基化miR-199a表达下降，去甲基化则表达上调。而有研究发现肝癌组织和对照组织中miR-199a-3p的启动子都有高甲基化，可见启动子甲基化不是造成miR-199a-3p表达量差异的原因。同时在miR-199a转录调控区发现H3K9和H3K27水平增加，且该两种组蛋白与转录抑制有关，还发现K3K4水平下降，K3K4甲基化与转录启动有关，说明组蛋白修饰直接影响miR-199a的表达［24］。与肝癌发生密切相关的还有miR-23b，有研究显示肝癌组织中miR-23b表达显著降低，肝癌组织中miR-23b有对肝再生终止的作用［25］。这些研究充分说明，microRNA在疾病中表达调控的多样性和复杂性。对这些基因的表达差异和变化进行分析有利于更好地了解各种相关疾病的发病机制，从而还有可能通过抑制或增强相关的调控microRNA找到治疗的方案，并设计出更有靶向功能的药物。

5 展望

miRNA在动物中的发现，以及对动物生长及代谢的调控是动物生物学研究领域的一个热点，也为相关研究提供了一个新思路。目前对miRNA的研究主要集中于发现其生物学效应和靶标上，至于其具体机制尚不清楚，例如目前研究的能够调控动物肌肉发育及脂质代谢的miRNA只是已经发现的近百种miRNA的一小部分，大多数的功能还都是个迷，因此，对于miRNA的研究上还有相当大的空间值得我们继续探索。关于miRNA在发育和代谢过程中所起的调控作用及其在某些病理过程中起的作用及其靶基因的研究，有望为某些动物疾病的治疗提供新的思路和方法，也使定向改变某些肉畜的肉质品质及生长速度成为可能。

［1］Zhang B，Stellwag E J，Pan X.Large-scale genome analysis reveals unique features of microRNAs［J］.Gene，2009，443（1-2）：100-109.

［2］李志娟，高士争，赵素梅.MicroRNA的生物学功能及其在动物肌肉和脂肪组织中表达的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2012，39（7）：102-107.

［3］杨永生，贺建华，邓惠中，等.肌肉生长抑制素对动物肌肉、脂肪和骨骼的影响［J］.动物营养学报，2012，24（2）：220-225.

［4］Huang M B，Xu H，Xie S J，et al.Insulin-like growth factor-1 receptor is regulated by microRNA-133during skeletal myogenesis［J］.PLoS One，2011，6（12）：129-173.

［5］黄 帅，朱杰宁，林秋雄，等.miR-1、miR-16和 miR-208前体在乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达［J］.热带医学杂志，2012，12（2）：123-126.

［6］Dey B.miR-206and-486induce myoblast differentiation by downregulating Pax7［J］.Mol Cell Biol，2011，31：203-214.

［7］Samuel J.Mir-206regulates pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and differentiation［J］.PLoS One，2012，7（10）：746-808.

［8］Feng Y，Cao J H，Li X Y，et al.Inhibition of miR-214expression represses proliferation and differentiation of C2C12 myo-blasts［J］.Cell Biochem Funct，2011，29：378-383.

［9］Sacco J K，Adeli K.MicroRNAs：emerging roles in lipid and lipoprotein metabolism［J］.Curr Opin Lipidol，2012，23（3）：220-225.

［10］Iliopoulos D，Drosatos K，Hiyama Y，et al.MicroRNA-370 controls the expression of microRNA-122and Cpt1alpha and affects lipid metabolism ［J］.J Lipid Res，2010，51（6）：1513-1523.

［11］Marquart T J，Allen R M，Ory D S，et al.miR-33links SREBP-2induction to repression of sterol transporters［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（27）：12228-12232.

［12］Horie T，Ono K，Horiguchi M，et al.MicroRNA-33encoded by an intron of sterol regulatory element-binding protein 2（Srebp2）regulates HDL in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（40）：17321-17326.

［13］Rayner K J，Suarez Y，Davalos A，et al.MiR-33contributes to theregulation of cholesterol homeostasis［J］.Science，2010，328（5985）：1570-1573.

［14］Cirera-salinas D，PautA M，Allen R M，et al.miR-33regulates cell proliferation and cell cycle progression［J］.Cell Cycle，2012，11（5）：922-933.

［15］Davalos A，Goedekel，Smibert P，et al.miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（22）：9232-9237.

［16］Li H，Zhang Z，Zhou X，et al.Effects of microRNA-143in the differentiation and proliferation of boine intramuscular preadipo-cytes［J］.Mol Biol rep，2011，38（7）：4273-4280.

［17］李鹏昊.miR-27a、miR-143对猪脂肪沉积和 miR-1、miR-206对肌肉肥大的调控研究［D］.四川雅安：四川农业大学，2011.

［18］任红艳.小鼠miR-200家族在体型控制和脂肪形成中的功能研究［R］.中国农业科学院博士后研究工作报告，2012.

［19］van Rooij E，Sutherland L B，Thatcher J E，et al.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29in cardiac fibrosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA.2008；105（35）：13027-13032.

［20］Taulli R，Bersani F，Foglizzo V，et al.Themuscle-specifi cmicroRNA miR-206blockshuman rhabdomyosarcoma growth in xenotransplanted mice by promotingmyogenic differentiation［J］.J Clin Invest，2009，119（8）：2366-2378.

［21］Kai Z S，Pasquinelli A E.MicroRNA assassins：factors that regulate the disappearance of miRNAs［J］.Nat Struct Mol Biol，2010，17（1）：5-10.

［22］侯 宁，王 剑，李振华，等.心肌细胞过表达 miR-27b导致小鼠发生心肌纤维化和线粒体损伤［J］.遗传，2012，34（3）：326-334.

［23］李美航.miR-103对猪前体脂肪细胞分化作用的研究［D］.陕西杨凌：西北农林科技大学硕士研究生学位毕业论文，2012.

［24］Hou J，Lin L，Zhou W，et al.Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Cell，2011，19：232-243.

［25］袁 斌.MiR-23b在大鼠肝再生终止阶段的表达及作用机制研究［D］.上海：第二军医大学博士学位论文，2011.