陕西某奶牛场隐性乳房炎病原菌分离鉴定及药敏试验

高海慧，任 敏，郭抗抗，张彦明

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

奶牛乳房炎是奶牛养殖中最常见的一种疾病，发病率高，危害广泛。尤其是隐性乳房炎，发病率远高于临床型乳房炎，不仅使奶牛的产奶量下降，而且使牛奶变性蛋白增多，影响牛奶质量，降低牛奶营养价值，危害人体健康，有碍公共卫生，严重制约了奶牛业的发展［1］。据美国国家乳房炎委员会（NMC）1996年统计，全球每年因乳房炎造成的损失约为350亿美元［2］。据彭丽英等［3］统计，我国奶牛乳房炎的发病率高于世界平均水平，每年造成的损失约1 135亿元。

引起奶牛乳房炎的病原微生物极为复杂，但不同奶牛场乳房炎分离菌存在差异。因此，及时准确的掌握奶牛场奶牛乳房炎的病原菌种类及其药敏情况，对奶牛场奶牛乳房炎的有效防治具有重要作用。

本试验调查的奶牛场为新建场，采用水冲式粪污处理系统、精饲料加工储存系统、高效智能的转盘式挤奶系统，饲养管理水平较好，该牛场共有530头正常在挤奶台挤奶的泌乳奶牛，平均胎次2.5，平均泌乳量30kg/d。由于奶牛隐性乳房炎不易被发现、对疾病监测意识弱，使得奶牛隐性乳房炎普遍存在，长期使用抗生素进行治疗，造成许多病原微生物产生耐药性，给乳房炎的治疗带来困难。为了查明该牛场隐性乳房炎的发病情况、病原菌的种类及主要病原菌的耐药性，对该牛场的165头临床健康奶牛进行隐性乳房检测，采集48份隐性乳房炎阳性样品，进行了病原菌的分离鉴定、药敏试验，以期对该牛场预防和治疗乳房炎提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 乳样 用乳房炎诊断液（LMT）对陕西省某奶牛场临床健康奶牛诊断为阳性的奶牛，采集乳房炎阳性样品48份。

1.1.2 培养基及试剂 50g/L脱纤维绵羊血琼脂培养基、营养肉汤、血清肉汤、营养琼脂培养基按常规方法配置［4］；麦康凯培养基、伊红美蓝培养、高盐甘露醇培养基、TTC-沙堡罗培养基、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；生化鉴定管购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳样的LMT检测 先用浸有750mL/L酒精的抹布擦干净乳房，弃去前3把奶，将各乳区的乳汁挤入专用检测盘中，45°倾斜，在各乳盘中加入等量的LMT诊断液2mL，缓慢作同心圆摇动10 s，观察现象。判定标准：无凝集现象判定为阴性；诊断盘底部似有微量沉淀或有黏附性黏液沉淀判定为弱阳性；沉淀物聚集呈紫色判定为阳性；出现凝集成团现象判定为强阳性。

1.2.2 隐性乳房炎阳性乳样的采集 采集乳样前，先用1g/L新洁尔灭消毒，然后用750mL/L的酒精棉球消毒乳头，每个乳头弃去头三把奶，无菌操作，每个乳区采集奶样6mL～10mL于灭菌离心管中，酒精灯灭菌后加盖封紧，标明牛号，乳区，放入存有冰袋的保温盒内，立即送回实验室检验。

1.2.3 细菌的分离培养 将无菌采集的样品摇匀后，用移液枪取250μL接种于6mL血清肉汤中，置于37℃恒温培养箱培养24h～36h。取增菌血清肉汤，用接种环接种于鲜血琼脂培养基，营养琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，高盐甘露醇培养基，TTC-沙堡罗培养基中，置于37℃恒温培养箱培养24h～48h。观察菌落形态，染色镜检，结合溶血情况初步判定细菌类属，分为葡萄球菌、链球菌、革兰阴性杆菌和革兰阳性杆菌等。进一步纯化培养，将纯培养物接种于营养肉汤中增菌备用，其中链球菌接种于含50mL/L血清的营养肉汤中。

1.2.4 分离菌的生化试验鉴定 将纯化培养的菌株进行生化试验鉴定。染色、镜检符合葡萄球菌的细菌进行兔血浆凝固酶试验，依据试验结果将其分为金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌；镜检形态符合链球菌的细菌用马尿酸钠、七叶苷、甘露醇、山梨醇、乳糖、水杨苷等进行生化试验鉴定；镜检符合革兰阴性杆菌的细菌进行硫化氢、靛基质、MR、VP、甘露醇等试验进行鉴定。镜检符合革兰阳性杆菌的不进行鉴定。

1.2.5 主要病原菌的药敏试验 选择从不同乳样中分离出的主要病原菌金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌，应用纸片扩散法进行药物敏感性试验，即吸取0.02mL纯培养菌悬液于MH琼脂平板上，其中链球菌接种于血液琼脂平板上，用L棒将菌液均匀涂布，加盖后放置8min左右，待平板面稍干，用镊子放置药敏纸片，轻压使其紧贴平板表面。用直径90mm的平皿，贴纸片5张，贴好纸片后，置于37℃恒温培养箱培养24h，测量抑菌圈直径。检测分离的主要病原微生物对于阿莫西林、四环素、氨苄西林、克林霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素、林可霉素等药物的敏感性，药敏试验判定标准按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁布的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》的标准进行。

2 结果

2.1 LMT法检测结果

LMT法检测的165头无临床乳房炎症状的奶牛中，隐性乳房炎阳性为72头，头阳性率为43.64%。检测660个乳区，乳区阳性率为24.46%。隐性乳房炎各乳区均可发生，经卡方检验，各乳区隐性乳房炎检出率差异不显著（P＞0.05）（表1）。

隐性乳房炎各胎次都可发生，以1～2胎次奶牛发病率最低，随着胎次的增加，隐性乳房炎发生率呈上升趋势，经卡方检验，组间差异极显著（P＜0.01），说明奶牛隐性乳房炎的发生率与胎次有一定关系（表2）。

调查结果表明，任何年龄的奶牛都会发生隐性乳房炎，奶牛隐性乳房炎的发生率随着年龄的增长而有所上升，经过卡方检验，组间差异显著（P＜0.05）（表3）。

表1 乳房炎与乳区的关系Table 1 The relationship of mastitis and the area of breast in cows

表2 隐性乳房炎发病率与胎次的关系Table 2 The relationship of subclinical mastitis and the delivery times in cows

表3 隐性乳房炎发病率与年龄的关系Table 3 The relationship of subclinical mastitis and the age in cows

2.2 细菌分离鉴定结果

对48份隐性乳房炎阳性乳样进行细菌的分离鉴定，从中分离出11种107株细菌，鉴定出金黄色葡萄球菌32株，占29.90%；凝固酶阴性葡萄球菌10株，占9.35%；无乳链球菌7株，停乳链球菌2株，乳房链球菌4株，粪链球菌2株，链球菌合计15株，占14.02%；大肠埃希菌14株，占13.08%；酵母菌9株，占8.41%。由葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌引起的乳房炎占总数的66.36%。说明该奶牛场奶牛隐性乳房炎的主要病原菌为葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌。病原混合感染率达81.25%（表4）。

表4 主要病原菌分离鉴定结果Table 4 The results of main pathogen isolation and identification

2.3 药敏试验结果

本试验分离的主要病原菌中大部分对阿莫西林、链霉素、青霉素、氨苄西林耐药，对氯霉素、氧氟沙星、阿米卡星、环丙沙星敏感（表5）。

表5 3种主要病原菌药敏试验结果Table 5 The results of three main pathogens of the antimicrobial susceptibility test

3 讨论

本试验对陕西省某规模化奶牛场进行了隐性乳房炎调查，结果表明隐性乳房炎的头阳性率为43.64%，乳区阳性率为24.46%。分析数据看出奶牛隐性乳房炎随着年龄和胎次的增加呈上升趋势，隐性乳房炎头阳性率低于国际上公布的50%，也低于国内付新成［5］报道的头阳性率56%、罗志尧等［4］报道的56.94%。调查结果表明，奶牛隐性乳房炎与奶牛场的规范化管理密切相关，被调查的奶牛场管理水平较好，能够坚持开展奶牛乳房炎防治措施，包括挤奶前后乳头药浴、奶牛干奶期使用干奶药物、每月一次奶牛临床型乳房炎普查等，使得奶牛乳房炎发病率处于较低水平。

对所采集的阳性乳样进行病原菌的分离鉴定，分离出11种107株细菌，其中葡萄球菌的检出率最高，为39.25%，金黄色葡萄球菌的检出率为29.91%，与金黄色葡萄球菌是实验室诊断检出率最高的细菌的报道［6］相一致；链球菌占14.02%；大肠埃希菌占13.08%。由葡萄球菌，链球菌和大肠埃希菌引起的乳房炎占总数的66.36%。说明该牛场奶牛乳房炎的主要病原菌为葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌。病原菌的混合感染率为81.25%，而且以2种～3种病原菌的混合感染为主。

致病菌主要在挤奶过程中传播，如通过擦洗乳房的毛巾、水、挤奶员的手、挤奶杯的交叉感染等途径传播；环境性致病菌主要通过垫料、粪便、泥土等途径传播。因此，预防奶牛隐性乳房炎应该采取如下措施：重视乳房炎病牛的监控，要做到早发现、早治疗；严格执行挤奶操作规程，建立稳定、训练有素的挤奶员队伍，从而提高执行挤奶操作规程的自觉性，加强挤奶卫生，坚持挤奶前后进行乳头药浴；在干奶期使用干奶药物，预防乳房炎的发生；定期消毒，保持牛舍内外干燥清洁，及时清理粪便；均衡奶牛日粮营养等。应该有预防为主、治疗为辅的理念。

分离的病原菌中大部分对阿莫西林、链霉素、青霉素、氨苄西林耐药，用传统的青链霉素疗法显然效果不佳。随着抗菌药物的广泛使用和耐药菌株的增多，细菌对常用抗生素的耐药性越来越强，这不仅给奶牛乳房炎治疗的药物选择带来很大困难，而且这些耐药基因可以在各菌株、动物和人类之间传播，从而造成广泛的耐药性［7］，给人类用药带来问题。所以，在临床上有必要对奶牛乳房炎病原菌进行分离鉴定和药敏试验，有针对性的用药和交叉用药，以得到最佳的治疗效果。

［1］姚海儒，李长存，王春景.奶牛隐形乳房炎调查［J］.中国兽医杂志，2008（6）：40-41.

［2］刘 朝，王京仁，张成栋，等.湖北地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定与耐药性分析［J］.中国奶牛，2007（7）：35-38.

［3］彭丽英，田文霞.奶牛乳腺炎防治研究进展［J］.中国动物检疫，2005，22（3）：44-45.

［4］罗志尧，陈天来.奶牛乳房炎大肠杆菌的鉴定与药敏试验［J］.江西畜牧兽医杂志，2013（4）：11-13.

［5］付新城，庞树坤.奶牛隐形乳房炎病原菌的分离及药敏试验［J］.动物医学进展，2010（S1）：169-174.

［6］Junaidu A U ，Salihu M D.Prevalence of mastitis in lactating cows in some selected commercial dairy farms in sokoto metropolis［J］.Adv Appl Sci Res，2011，2（2）：290-294.

［7］马 龙，张 勇，常卫华，等.兰州地区奶牛临床型乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验［J］.甘肃农业大学学报，2011，8（4）：13-16.