基于microRNA表达谱技术的肺纤维化研究进展

李文超，张迎建，杨红

(东南大学公共卫生学院，环境医学工程教育部重点实验室,江苏 南京 210009)

肺纤维化是一组由多种病因引起的肺破坏性疾病,包括继发因素导致的肺纤维化和特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF),其病理过程为当肺内纤维母细胞受到物理、化学或生物因素作用时分泌胶原蛋白修补肺间质组织,进而造成肺纤维化。肺纤维化的典型特征是肺间质中胶原和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积,且普遍伴有转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)[1]及白细胞介素(IL)- 1、- 6等多种炎症介质的表达增加。环境、物理、药物、个体差异与遗传因素等均与肺纤维化发生有关,但其具体机制仍不明确。由于微小RNA(microRNA,miRNA)参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物进程,其表达异常会导致组织器官的癌变及纤维化等疾病[2- 4],因此miRNA对肺纤维化的基因表达调控日益成为研究的热点。近年来,一些研究结果显示,miRNA与肺纤维化的发生发展密切相关[5]。在本文中作者对几种miRNA在肺纤维化过程中所起作用的最新进展作一综述,以期为深入了解肺纤维化的发生机制及防治措施提供新思路。

1 miRNA表达谱技术

miRNA表达谱是指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的cDNA文库,收集cDNA序列片段,定性、定量分析其miRNA群体组成,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的miRNA表达种类和丰度信息,编制成的数据表就称为miRNA表达谱。miRNA表达谱分析技术是基于核酸杂交和扩增的原理。miRNA表达谱的研究主要分为3个阶段,即miRNA的初步筛选、差异表达分析和调控机制研究。对于miRNA表达谱检测技术有多种选择。针对miRNA初步筛选的克隆测序类技术,主要有454焦磷酸测序技术、Solexa合成测序技术和SOLiD连接测序技术[6]等;对于miRNA表达谱分析的高通量芯片技术,包括固相微阵列芯片和Luminex- xMAP液态芯片技术[7];实时荧光定量PCR(qPCR)和经典的Northern印迹等技术广泛应用于研究miRNA表达调控机制。对miRNA表达谱的研究方法还有引物入侵法[8]、桥连同位素标记法[9]、纳米金标法[10]、单分子检测法[11]等,由于这些技术缺乏一定的高通量特性、灵敏性或因其耗时长、成本高,在科研应用中有一定的局限性。

在正常生理和病理状态下,了解miRNA的时空表达特性是全面理解miRNA功能的基础,miRNA表达谱分析和生物信息学方法预测靶基因为认识miRNA的功能提供了新视角,以期通过整合调控miRNA表达的上游转录因子和miRNA的下游靶标,建立一个miRNA调控的包含细胞分化和代谢的遗传通路和网络,阐明miRNA相关网络的混乱会如何引起病损,最终为疾病的早期发现和诊断以及治疗提供新的切入点。

2 miRNA在肺纤维化中的表达调控

2.1 miR- 29

研究发现,miR- 29在不同的组织细胞中表达不同,尤其是在肺、肾脏和心脏组织细胞中表达量显著增加[12],因其可抑制TGF-β1的致纤维化通路以及ECM的合成,并有抗纤维化的功效而备受关注[13]。Cushing等[14]发现,miR- 29和其下游靶基因COL3A1、COL4A1的表达在博莱霉素诱导的肺间质纤维化发展过程中呈负调节作用。miR- 29调节与纤维化相关的大多数基因,包括COL1A1、COL1A2、COL3A1等,在与纤维化相关的45个基因中有23个(51%)确定为miR- 29的目标基因。TGF-β1可使所有的miR- 29家族成员表达下调,下调的miR- 29可能导致TGF-β1的控制基因脱抑制。miR- 29作为TGF-β1的下游基因,通过调节TGF-β1的信号强度调节与纤维化相关的大多数基因表达,进而影响胶原蛋白以及层粘连蛋白的产生。因此,miR- 29是肺纤维化的一个主要调节相关基因。

Jun 等[15]发现,miR- 29是Smad3的一个下游靶基因,在博莱霉素诱导的小鼠肺间质纤维化过程中受TGF-β/Smad信号的负调控。同时,miR- 29的过度表达可能负反馈调节TGF-β和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表达以及Smad3信号通路。将睡美人(sleeping beauty,SB)介导的miR- 29基因转移到正常的和病变的肺组织中,可以对肺间质纤维化起到预防和治疗的效果。因此,对miR- 29的进一步研究可能为治疗肺间质纤维化提供靶向药物和新的治疗方向。

2.2 miR- 21

miR- 21被发现与肺纤维化过程中肌成纤维细胞分化有关。Liu等[16]的研究显示,在博来霉素诱导肺纤维化实验小鼠和IPF患者肺组织中,miR- 21主要集中于肌成纤维细胞中且表达上调。研究人员推测,miR- 21可能通过抑制Smad蛋白、Smad7的表达从而实现对纤维化的调控。给予miR- 21反义核苷酸探针可以明显降低实验小鼠的纤维化程度,并且α- 平滑肌激动蛋白(α- smooth muscleactin,α- SMA,肌成纤维细胞特异性标志)表达不增加。TGF-β1可以增加初级肺纤维母细胞内的miR- 21表达,miR- 21水平升高进而可以增强纤维母细胞内TGF-β1的促纤维化作用,反之,将miR- 21进行基因沉默后可削弱其促纤维化能力,这说明miR- 21在诱导肌成纤维细胞分化中起重要作用。

2.3 miR- 155

miR- 155因在成纤维细胞中抑制角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,FGF7/KGF)的表达并增加其迁移而引起关注。Martin等[17]首次发现miR- 155的纤维化相关指标是Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体(AT1受体)。另有研究发现,AT1在博来霉素处理的小鼠与IPF患者的肺间隙成纤维细胞中表达增加[18],其水平的增加可导致成纤维细胞中胶原蛋白合成的活性增强,进而影响肺纤维化进程[19]。

Pottier 等[20]研究发现,miR- 155的表达上调可由肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL- 1β引起,而其下调可由TGF-β引起。该研究显示,FGF7/KGF是miR- 155的一个目标。miR- 155可与FGF7/KGF的3′- UTR结合,下调FGF7/KGF。同时,miR- 155在特发性肺纤维化患者的肺组织中的表达上调[21]。这些研究结果提示miR- 155在上皮间质转化机制的调节中起重要作用。

2.4 miR- 149

对miR- 149的研究表明,miR- 149在细胞增殖、凋亡及炎症反应中可能发挥重要作用。miR- 149在舌鳞癌以及肾透明细胞癌中表达降低[22- 23],在鼻咽癌组织中表达增加[24]。在对鼻咽癌组织的研究发现,miR- 149通过抑制E- 钙黏蛋白的表达参与了上皮细胞向间质细胞的转化(epithelial- to- messenchymal,EMT)过程[25],而EMT是肺纤维化早期的一个重要体现,因此miR149有可能导致肺纤维化。Wang等[26]在研究前体miRNA的常见基因突变与罹患煤工尘肺风险的关系时发现,位于miR- 149前体的rs2292832单核苷酸多态性位点TT基因型可明显增加煤工尘肺的患病风险。王莎莎等[27]对一期、二期、三期煤工尘肺病人共27例进行了全基因组miRNA测序、靶基因预测及信号通路分析等,发现在所有病例组变化方向一致的miRNA中,miR- 149表达下调。在此基础上,制备矽尘诱导肺纤维化小鼠模型,检测到肺组织内miR- 149表达下调、IL- 6表达上调,肺泡壁中有大量炎症细胞浸润,肺泡结构略有增厚;体外实验中,经矽尘处理的呼吸系统上皮细胞中同样也检测到miR- 149的表达降低以及IL- 6的表达增多,而上皮细胞是矽尘引起肺纤维化早期的主要效应细胞之一。这说明SiO2粉尘可导致小鼠肺组织产生炎症反应,miR- 149的下调及IL- 6的上调可能参与了肺部炎症、肺纤维化等疾病的发生过程。这可能为进一步揭示肺纤维化的发病机制提供理论依据。

2.5 let- 7d

Let- 7家族是近年来研究较多的一类miRNA,最早在研究线虫时被发现,参与调控细胞分化和增殖时序。其中,let- 7d位于肺泡上皮细胞内,与肺纤维化密切相关。Marshall等[19]研究结果显示,在肺纤维化尤其是IPF病人中,let- 7d的表达显著降低。let- 7d表达减少可导致胶原蛋白沉积增加,肺泡间隔增厚。在体外试验中[28],let- 7d与TGF-β1关系密切,TGF-β1可抑制let- 7d的表达。let- 7d与肺泡内皮细胞间质HMGA2(high mobility group AT- hook 2)、ACTA2及COLIA1的表达呈负相关,并使内皮标志物CDH1、TJP1表达降低。其中,HMGA2是let- 7d的一个已知靶位点[29],同时是EMT的调节器[30]。而在体内试验中[28],抑制let- 7d的表达可使肺泡壁增厚,而将miRNA高效阻断剂通过气管给药从而抑制let- 7d的表达,结果导致了EMT的发生,进而引起肺纤维化。由此可见,抑制let- 7d的表达可能是肺纤维化中细胞表型显著变化的一个关键调控点,可能为肺纤维化尤其是IPF的治疗提供新思路。

2.6 miR- 200

Gregory等[31]发现miR- 200家族通过E- 钙黏蛋白的转录抑制因子ZEB1和SIP1靶向调节EMT,增强其表达可阻止TGF-β诱导EMT的发生。Yang等[32]报道,miR- 200家族在博莱霉素致肺纤维化小鼠的肺部(主要为miR- 200a、miR- 200b和miR- 200c)和IPF患者的肺内(主要为miR- 200a、miR- 200c)表达显著下调。miR- 200家族在肺泡上皮细胞中表达量高于肺成纤维细胞,并且可以通过抑制由TGF-β1诱发的肺泡上皮细胞的EMT,从而起到抗纤维化作用。由此,miR- 200家族在肺纤维化发生过程中起重要作用,增强其在肺部的表达有可能成为一种新的治疗肺纤维化疾病的方法。

2.7 其他

研究发现,在囊肿性肺纤维化病人的肺内上皮细胞中,与非囊肿性肺纤维化病人的肺组织相比较,miR- 126的表达水平降低。miR- 126可调节TLR2/4信号通路的TOM1基因的表达,而其表达下调可导致TOM1基因的表达增加[33- 34]。这表示miR- 126可能与肺纤维化的发生相关。

同时,IPF患者的肺成纤维细胞中miR- 17～92簇的表达下调[35],miR- 154表达上调[36]。

3 miRNA与肺纤维化的治疗

miRNA转录后可调控mRNA,这可能调控着至少1/3的人类编码蛋白基因[37- 39]。较多的研究表明,miRNA在肺纤维化中起到调控作用,尤其是miR- 29、miR- 21、miR- 149等。 miR- 29可引发特定传导信号,导致胶原蛋白以及层粘连蛋白的产生,从而使ECM的沉积增加或减少;miR- 21和miR- 155可调节肺成纤维细胞的分化和增殖;miR- 149则是通过参与免疫因子调控进而影响肺纤维化进程。这些miRNAs的异常表达可以影响肺纤维化疾病的发生。因此,可以选择特定的miRNA干预其靶基因所调控的疾病的发生发展。理论上,对于miRNA表达增加的疾病,给予反义核苷酸(如LNA反义寡核苷酸)阻断miRNA的活性[40],或者通过干预相关活化的信号转导通路(如巨噬细胞NF- κB信号通路)[41],从而恢复其正常调节水平;而对于miRNA表达减少所致的疾病,通过构建相关表达载体,将含有目标miRNA导入体内重建其表达,以期达到治疗疾病的目的。

随着对miRNA及其靶mRNA研究的深入,将更有利于完善对 miRNAs在肺组织中的生理调节、疾病发生和发展中作用的理解,为疾病的预防[42]、临床诊断及治疗提供新的依据和方向。

4 小结与展望

miRNA自从被发现以来,其相关调控疾病机制的研究取得了巨大进展。由于检测miRNA表达方法的技术平台不断发展,这为研究miRNA引发肺纤维化的机制、早期诊断以及相关治疗开发了新视角。尽管对miRNA的研究越来越多,但目前对肺纤维化中miRNA的表达调控具体机制了解甚少。同时,将miRNA应用于临床诊断和治疗仍有一些亟待解决的问题,如：肺纤维化特别是IPF的发病机理并不明确,miRNA在其中发挥的作用还有待进一步实验证实;miRNA差异表达的调节网络尚未清楚;将miRNA导入体内的最佳途径以及如何使其发挥作用等。相信在不久的将来,miRNA作为特异、灵敏的新型生物标记物,会为研究肺纤维化的发生发展提供新思路,为肺纤维化的诊断、治疗和预后判断开发新视野。

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