类泛素蛋白ISG15研究进展

刘 诚，赵倩楠，李晓泉，李晓宁，梁晶晶，张 珂，应 雪，罗廷荣＊

（广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004）

干扰素刺激基因15蛋白（interferon-stimulated gene 15，ISG15）是一种类泛素蛋白，分子质量约为17ku，可在干扰素刺激下由isg15基因编码产生。其不仅在序列、结构上与泛素类似，而且在功能上也同泛素一样，可通过酶级联反应共价修饰靶蛋白。

1 ISG15的结构

ISG15具备2个前后串联的类泛素功能域，可与泛素的特异性抗体发生交叉反应，因此被称为泛素交叉反应蛋白（ubiquitin cross-reaction protein，UCRP）。通过分析氨基酸序列，发现ISG15由2个类泛素小亚基通过铰链区连接组成，其中N端和C端功能域分别与泛素具有33%和32%的氨基酸同源性，并且C末端具有一个高度保守的基序“Leu Arg Leu Arg Gly Gly（LRLRGG）”，该双甘氨酸序列为泛素或类泛素修饰蛋白结合靶蛋白的核心序列，对于共价修饰靶蛋白是必需的［1］。ISG15最初以前体蛋白的形式表达，经蛋白酶作用切除C端延伸后，暴露双甘氨酸序列，成为具有生物活性的成熟蛋白形式。ISG15的2个功能域在类泛素修饰过程中分别发挥着不同作用。其中，C端功能域可与类泛素E1激活酶和类泛素E2结合酶依次结合，而N端功能域则保障ISG15在类泛素E3连接酶介导作用下转移至靶蛋白。

2 ISG15的类泛素修饰系统

ISG15类泛素修饰系统与泛素-蛋白酶体系统类似，同样是一系列酶级联反应，可分为两个阶段。其中，ISG15通过双甘氨酸序列与靶蛋白结合，并进行共价修饰的过程被称为ISG化（ISGylation）；将ISG15从靶蛋白上移除的过程被称为去ISG化（deISGylation）。

参与ISG化过程的酶类包括类泛素E1激活酶、类泛素E2结合酶和类泛素E3连接酶，而进行去ISG化则为一系列解聚酶。经研究鉴定，UBE1L是类泛素E1激活酶，UBCH6和UBCH8是类泛素E2结合酶，EPF、HERC5和TRIM25是类泛素E3连接酶，UBP43（USP18/ISG43）、USP2、USP5、USP13 和USP14是解聚酶。目前仅有UBE1L这种类泛素E1激活酶被认为是ISG15类泛素修饰系统所特有的，其他的酶类均与泛素-蛋白酶体系统通用。

ISG15类泛素修饰系统中所有的酶类均可由干扰素刺激产生，同时囊括了这一可逆性反应的两个方面，说明在固有免疫反应过程中ISG15结合靶蛋白的水平处于动态平衡。

病毒或细菌感染可以促使蛋白酶加工ISG15前体蛋白，将其C端延伸切除并暴露双甘氨酸序列形成ISG15成熟蛋白形式；之后，类泛素E1激活酶的半胱氨酸活化位点与ISG15的C端形成高能硫脂键，这一阶段需要ATP提供能量；被激活的ISG15随后通过转酯作用转移至类泛素E2结合酶上，同样以其C端与类泛素E2结合酶的半胱氨酸活化位点形成高能硫脂键；最后，在类泛素E3连接酶的辅助下，ISG15利用C端双甘氨酸的羧基与靶蛋白赖氨酸的ε-氨基形成异肽键，完成靶蛋白的ISG化修饰［2］。此外，ISG15解聚酶可将ISG15从被修饰的靶蛋白上移除，对ISG15进行循环利用，以平衡机体内ISG15偶联细胞蛋白的数量。

ISG15类泛素修饰并不介导蛋白降解，而是发挥生理信号功能，与基因转录调控、蛋白质翻译以及机体应激反应等生理过程有着密切联系。这一特点与蛋白K63型泛素化修饰相似，并且明显区别于蛋白K48型泛素化修饰，后者修饰的靶蛋白具有以K48位连接的泛素链，可被蛋白酶体识别并降解。

3 ISG15的抗病毒活性

在研究辛德毕斯病毒（Sindbis virus，SV）感染时首次观测到ISG15的抗病毒活性，结果表明干扰素刺激基因蛋白在该病毒感染过程中发挥重要作用［3］。通过对辛德毕斯病毒进行改造，可获得表达不同干扰素刺激基因的多个重组辛德毕斯病毒，利用其感染IFNAR-/-的小鼠后，测定这些重组辛德毕斯病毒的杀伤力，以此评价不同干扰素刺激基因的抗病毒活性。相比之下，表达ISG15的重组辛德毕斯病毒不仅可以抑制病毒，而且能够保护小鼠免受病毒杀伤。之后，关于ISG15抗病毒活性的报道层出不穷，通过利用ISG15过表达或基因沉默技术，发现ISG15在多种病毒感染过程中发挥重要作用。大量研究证明，流感病毒（Influenza virus，IV）、牛痘病毒（Vaccinia virus，VV）、水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）、仙台病毒（Sendai virus，SeV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、禽类造肉瘤-白细胞增生病毒（Avian sarcoma leukosis virus，ASLV）、人乳头状瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）、人类免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus 1，HIV-1）、埃博拉病毒样颗粒（Ebola virus-like particles）、登革病毒（Dengue virus，DV）和西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）均可被ISG15体外适度抑制［4-7］。

相对于体外试验而言，体内试验更能正确反映动物机体的生理和病理状态。因此，许多试验采用缺乏ISG15的基因小鼠作为研究模型，以确认其抗病毒活性。ISG15-/-小鼠比野生型小鼠对辛德毕斯病毒感染所造成的杀伤性更为敏感。如果感染的重组辛德毕斯病毒能够表达野生型ISG15，则可以降低病毒对ISG15-/-小鼠的杀伤性；当重组病毒所表达的ISG15在C末端双甘氨酸基序发生突变，甘氨酸被丙氨酸所替代，ISG15突变体丧失结合靶蛋白能力时，ISG15-/-小鼠同样更为容易感染辛德毕斯病毒。以上研究结果表明，ISG15抗辛德毕斯病毒的活性依赖于其结合靶蛋白的能力［8］。进一步研究结果显示，UBE1L-/-小鼠也较野生型小鼠对辛德毕斯病毒感染更为敏感，证实ISG15的保护力取决于其对靶蛋白的类泛素修饰［9］。

ISG15-/-小鼠感染甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）和乙型流感病毒（Influenza B virus，IBV）后，同样可以观察到比野生型小鼠更高的病死率［10］。野生型小鼠感染乙型流感病毒后，仅为最低程度的体重减轻或其他临床症状，并且在整个感染过程中，病毒载体均处于非常低的水平。与之相反，ISG15-/-小鼠出现显著的体重减轻，感染后期的病毒载体高于野生型小鼠的1 000倍以上。以上试验结果适用于乙型流感病毒小鼠适应毒株Lee/40和非小鼠适应毒株Yamagata/88，表明ISG15可能导致乙型流感病毒仅能感染有限物种。乙型流感病毒感染UBE1L-/-小鼠后，表现出较野生型小鼠更强的杀伤性和更多的血液病毒含量，说明ISG15针对乙型流感病毒所提供的保护力依赖于其类泛素修饰系统发挥作用。

以辛德毕斯病毒和流感病毒为研究对象的试验初步确定了ISG15具备体内抗病毒活性。此后，更多的研究证实ISG15同样可以针对其他病毒提供保护力，例 如，基 孔 肯 雅 病 毒 （Chikungunya virus，CHIKV）、单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1，HSV-1）、γ疱疹病毒68型（Gamma herpes virus 68）和牛痘病毒。虽然ISG15能够影响多种病毒，但并不意味着ISG15-/-小鼠对所有病毒的易感性都会增加，例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）、水疱性口炎病毒和西尼罗河病毒［11-12］。自从ISG15发现以来，大量的研究均着眼于ISG15的类泛素修饰。关于辛德毕斯病毒和乙型流感病毒的前期研究，表明ISG15的抗病毒活性与其类泛素修饰靶蛋白的能力相关，说明ISG化过程对于宿主对抗病毒十分重要。但是，近期有报道称相对野生型小鼠而言，ISG15-/-小鼠和UBE1L-/-小鼠可对基孔肯雅病毒表现出相似的易感性，说明ISG15在病毒感染过程中可能发挥某些不依赖于类泛素修饰系统的作用。相似的研究结果同样发生在罗斯河病毒（Ross River virus，RRV）上。

各种体内和体外试验证明ISG15可针对多种病毒发挥抗病毒活性，包括逆转录酶病毒（人类免疫缺陷病毒1型、禽类造肉瘤-白细胞增生病毒）、大DNA病毒（牛痘病毒、单纯性疱疹病毒1型）、正链RNA病毒（辛德毕斯病毒）和负链RNA病毒（甲型流感病毒）等［13-14］。因此，ISG15发挥其抗病毒活性的机制同样可能是多种多样。

4 ISG15的生物活性机制

4.1 抑制病毒释放

关于人类免疫缺陷病毒1型、禽类造肉瘤-白细胞增生病毒和埃博拉病毒（Ebola virus，EBV）的研究已经发现，ISG15能够影响这些病毒生命周期中的释放阶段［15］。尽管ISG15实现其抗病毒效应均是通过抑制这些病毒释放，但是在其中所运用的机制却并不相同。ISG15通过阻断HIV-1Gag蛋白的泛素化，抑制Gag蛋白与Tsg101蛋白之间的相互作用，从而干扰HIV-1的出芽释放［16］。进一步研究表明，HERC5涉及ISG15类泛素修饰抑制HIV-1出芽释放的过程。与之前的研究不同，该试验证明在HIV-1Gag蛋白ISG化的过程中是由HERC5充当类泛素E3连接酶的。同时，缺乏HERC5辅助的ISG15过表达将造成Gag蛋白在细胞质中聚集，而在HERC5与ISG15共表达的情况下，Gag蛋白会聚集在细胞膜上［17］。以上研究结果表明ISG15的单体与其类泛素修饰系统可能通过两个不同的机制发挥抗HIV-1的作用。

ISG15同样可以通过相似的机理抑制埃博拉病毒样颗粒。单独表达埃博拉病毒的基质蛋白VP40，可形成VP40病毒样颗粒，并利用泛素E3连接酶Nedd4进行出芽释放。研究发现ISG15与VP40共表达能够降低Nedd4连接酶的活性，阻断VP40的泛素化，从而抑制VP40病毒样颗粒的释放［18］。同HIV-1的研究类似，单独过表达ISG15同样可以破坏制埃博拉病毒样颗粒的释放，说明单体形式的ISG15也可能具备抑制Nedd4连接酶活性的能力。Malakhova等研究证明，纯化的ISG15能够阻断泛素E2结合酶与Nedd4连接，阻止泛素转移至Nedd4的半胱氨酸残基上。根据EBV和HIV-1的研究结果可提出一个新颖的观点，即ISG15通过结合靶蛋白的泛素相互作用域或与泛素E2结合酶、E3连接酶形成硫酯键的方式，与泛素化修饰竞争，干扰由泛素介导的调控作用。此外，ISG15与UBC13赖氨酸残基的结合也能够抑制UBC13作为泛素E2结合酶的生物活性。因此，竞争靶蛋白的赖氨酸残基可能是ISG15对抗泛素化修饰的另一机制。

禽类造肉瘤-白细胞增生病毒的研究结果则揭示了ISG15抑制病毒出芽的另一种机制［19］。ASLV的出芽释放依赖于Gag蛋白与Nedd4结合。虽然ISG15同样可以抑制ASLV病毒样颗粒的释放，但在此过程中并不干扰Gag蛋白与Nedd4的相互作用。前人根据HIV-1的研究结果推测，ISG15或许是通过扰乱内吞体分选转运复合物（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT）通路的前期阶段实现其抗病毒活性的。研究者将HIV-1或者ASLV的Gag蛋白与ESCRT通路组成蛋白进行融合表达后，病毒样颗粒得以绕开ESCRT通路的前期阶段进行释放。Pincetic等的研究发现，ISG15通过对极性多泡体蛋白（charged multivesicular body protein，CHMP）5进行类泛素修饰，阻碍ESCRT通路中AAA类ATP酶家族成员Vps4的募集，从而抑制病毒样颗粒释放。

LCMV和HSV-1虽被证实可以利用ESCRT通路进行出芽释放，但是ISG15无法影响LCMV的致病机理或抑制HSV-1的复制，说明LCMV和HSV-1能够干扰ISG15对ESCRT通路的调控。为了更准确地了解ISG15抑制病毒释放的机制，确定ISG15调控ESCRT通路的方式是否仅针对于某些特定病毒，或者只是ISG15在膜泡运输方面发挥作用的某个现象，仍需进行深入研究。

4.2类泛素修饰病毒蛋白

重组辛德毕斯病毒的研究证明ISG15作为一类抗病毒分子，可在受病毒感染的细胞内发挥生物活性。沉默人体细胞中的isg15基因将促进甲型流感病毒的复制，说明ISG15可以直接抑制病毒复制，由此引发了探索ISG15类泛素修饰病毒蛋白可能性的后续研究［20］。现有证据表明，某些病毒蛋白的确是ISG15类泛素修饰的靶蛋白，对其进行ISG化修饰可抑制病毒复制，属于Ⅰ型干扰素抗病毒效应的一部分。

第一个被发现可作为ISG15类泛素修饰靶蛋白的病毒蛋白是甲型流感病毒的NS1蛋白［21-22］。研究证明，甲型流感病毒的NS1蛋白通过HERC5进行类泛素修饰后，会产生不同的功能效应。Zhao等发现ISG15对NS1蛋白的共价修饰可发生在多个赖氨酸残基位点上，而K41是NS1蛋白主要的类泛素修饰位点。对这一位点的修饰虽然不会影响NS1蛋白与双链RNA结合的能力，但是可以抑制其与输入蛋白α的相互作用，阻止NS1蛋白转移至细胞核内。若将甲型流感病毒NS1蛋白的K41位点突变为丙氨酸，则会降低NS1蛋白的类泛素修饰水平，削弱干扰素对病毒复制的抑制作用。ISG化的NS1蛋白不能与双链RNA依赖性蛋白激酶的N端、NS1蛋白的RNA结合域、U6小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）和双链RNA相互作用。在功能层面上，NS1蛋白的类泛素修饰可以降低其抑制干扰素刺激基因诱导表达的能力，将导致甲型流感病毒更容易受到抗病毒反应的影响。以上两项研究虽然由于采用了不同毒株而具有不同的发现，但是都进一步验证了ISG15可以通过直接修饰病毒蛋白抑制病毒复制的假设。

人乳头状瘤病毒的衣壳蛋白同样被证实是ISG15类泛素修饰的靶蛋白。使用HPV假病毒封装系统证明，ISG15类泛素修饰系统的表达将导致HPV衣壳蛋白的ISG化，造成病毒释放数量下降和感染性减弱。如果ISG化的衣壳蛋白参与组成病毒颗粒，将会造成病毒衣壳的几何学结构改变。因此，可推测出一种假设，即衣壳结构的改变会抑制病毒的感染性。HIV-1的Gag蛋白可通过HERC5被ISG15类泛素修饰。证明在病毒蛋白进行ISG化修饰与病毒复制受到抑制之间存在直接的因果关系。以上的试验结果均能够有助于解释ISG15类泛素修饰靶蛋白的某一位点是如何对病毒产生巨大的下游效应的。

4.3 类泛素修饰宿主蛋白

自从发现ISG15类泛素修饰可靶向新翻译的蛋白后，研究者就预测在干扰素刺激基因表达产物中存在着大量的靶蛋白。在第1个高通量鉴别ISG化蛋白的研究中发现，人类胸腺组织细胞的Jak1和STAT 1可被ISG15类泛素修饰。随后进行的蛋白质组学研究确定大量的干扰素刺激基因表达产物可作为ISG15共价修饰的靶蛋白，其中包括3种抗病毒效应分子，即干扰素调控因子3（IRF3）、视黄酸（维甲酸）诱导基因蛋白1（retinoic acid inducible gene 1，RIG-1）和双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）。

IRF3的ISG15类泛素修饰有助于其稳定激活，并正向调控Ⅰ型干扰素反应［23］。研究证明，仙台病毒的感染可以促使ISG15通过HERC5在IRF3的多个赖氨酸残基上进行ISG化修饰。经过类泛素修饰的IRF3可以阻断与PIN1的相互作用，避免其在被泛素化修饰后降解，从而加强干扰素反应。

将ISG15、UBE1L和UBCH8的表达质粒转染至COS-7细胞中，可发现RIG-1被ISG15类泛素修饰。过表达ISG15类泛素修饰系统可以不经由蛋白酶体介导而造成未ISG化的RIG-1减少，然而这种现象在UBE1L-/-小鼠胚胎成纤维细胞中却没有发现，暗示RIG-1的减少是由ISG15类泛素修饰介导的。遗憾的是，该研究并没有鉴定或突变ISG15的修饰位点，所以无法排除其他蛋白ISG化修饰后间接造成RIG-1蛋白水平下降的可能性。研究发现，RIG-1的减少会减弱针对新城疫病毒的干扰素反应。因此，无论RIG-1蛋白水平下降是何种蛋白共价修饰的结果，以上研究都说明ISG15并不总是引发更强烈的干扰素反应，而是在某些情况下调控干扰素反应至合适的强度。

蛋白质组学分析结果表明，双链RNA依赖性蛋白激酶同样是ISG15类泛素修饰的靶蛋白［24］。PKR能够在细胞受到干扰素或脂多糖刺激后被ISG15共价修饰，而突变分析则揭示了PKR的类泛素修饰位点在于K69和K159［25］。在不存在病毒RNA的情况下，肺成纤维细胞中的PKR同样可以通过ISG15激活；如果PKR的K69和K159全部突变为精氨酸，则获得的突变体将无法进行ISG化修饰，同时也会丧失基本激活能力，说明这种不依赖于RNA的激活作用是由ISG15类泛素修饰PKR造成的。当ISG15在PKR的N端融合表达时，增强的PKR激活作用使eIF2α的磷酸化水平上升，从而全面抑制蛋白质合成。以上研究结果表明，ISG15可能在病毒感染之前就已经对蛋白质翻译过程产生了广泛影响。

探索由ISG15介导的抗病毒效应分子调控机理固然重要，但也需要关注其他蛋白类泛素修饰后对病毒复制和致病机理所造成的影响。例如，CHMP5的ISG化修饰可抑制HIV-1的出芽释放。细丝蛋白B同交联肌动蛋白细丝一样，可以作为Jun氨基末端激酶（jun N-terminal kinase，JNK）信号转导通路的支架蛋白。ISG15能通过修饰细丝蛋白B破坏其结合RAC-1、MEKK1和MEKK 4的能力，从而调控干扰素诱导的细胞凋亡。共表达UBCH8和细丝蛋白B将导致两者在富含肌动蛋白的膜褶皱（actin-rich membrane ruffles）里发生共定位现象。虽然仅有少数细丝蛋白B被ISG15类泛素修饰，但是ISG15化的细丝蛋白B在膜褶皱这一局部微环境中的含量可能会相当高。这也就解释了为什么看似含量非常少的ISG化的细丝蛋白B可以对JNK信号转导通路产生如此大的影响［26］。

4.4 ISG15单体的生物学功能

ISG15除了具有共价结合的形式外，还可通过单体形式存在于细胞内外。近期的研究结果表明，单体形式的ISG15可在人或鼠类应对感染时发挥重要作用。采用体内试验证实，ISG15单体可在机体感染过程中发挥生物学相关功能。ISG15-/-初生小鼠对基孔肯雅病毒高度易感，然而在UBE1L-/-小鼠却没有发现类似现象，说明ISG15单体足以保护小鼠免受CHIKV的感染。

ISG15长期以来被认为具有细胞因子样生物活性。虽然ISG15自身没有用于释放的典型信号肽，但是干扰素体外刺激T细胞、B细胞、单核细胞和上皮细胞后均可发现ISG15释放。而释放到细胞外的ISG15可促进外周血液淋巴细胞中的自然杀伤细胞特异性增殖。重组ISG15通过刺激CD3＋T淋巴细胞分泌IFN-γ，从而促进自然杀伤细胞增殖，并提高其细胞毒性作用［27］。

除此之外，ISG15单体还可作为中性粒细胞的趋化因子。研究发现，在感染鼠疟疾和疟原虫的红细胞中存在ISG15，其能够显著增加中性粒细胞的趋化活性，并诱导释放嗜酸性粒细胞的趋化因子。

5 结论与展望

ISG15作为固有免疫中的一类重要分子，可在动物机体抗病毒效应方面发挥重要作用。目前已证明ISG15可针对多种病毒发挥抗病毒活性，包括逆转录酶病毒、大DNA病毒、正链RNA病毒和负链RNA病毒等。虽然针对各种病毒的具体机制并不相同，但是大体可分为四类：一是抑制HIV-1等病毒释放；二是类泛素修饰NS1等病毒蛋白；三是共价修饰IRF3等宿主蛋白；四是释放单体至细胞外，发挥其生物学功能。

对于ISG15及其类泛素修饰系统的研究尚处于起步阶段，仍存在大量问题需要进一步研究，尤其是病毒与蛋白之间的相互作用关系。鉴定ISG15共价修饰的靶蛋白、分析类泛素修饰对靶蛋白生物学特性的影响、探索ISG15针对特定病毒的具体分子机理等将是未来的研究方向。深入了解ISG15的生物学功能及其分子机理，将使我们更全面地了解动物机体的免疫调节功能，为研制病毒疫苗和抗病毒药物提供理论基础。

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