口蹄疫病毒反向遗传技术研究进展

任 方，易 忠，郭会玲，魏玉荣，马文戈，黄 炯＊

（1.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000；2.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

口蹄疫病毒反向遗传技术研究进展

任 方1，2，易 忠1，郭会玲1，魏玉荣1，马文戈1，黄 炯1＊

（1.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000；2.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的传染病之首，其暴发会严重影响畜牧业发展、人民生活以及国民经济。但目前对口蹄疫病毒的了解仍存在盲区，口蹄疫疫苗还有许多不足。病毒反向遗传学技术的飞速发展为口蹄疫病毒结构的深入研究与新型疫苗及其生物制品的研制提供了一种新的高效的技术方法。论文就国内外运用反向遗传学技术对口蹄疫病毒分子致病机理研究及利用反向遗传学操作技术研制新型FMD疫苗进行综述，并且展望口蹄疫病毒反向遗传学研究新动向。

口蹄疫病毒；感染性cDNA克隆；反向遗传学

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物的烈性高度接触性传染病。FMDV隶属于小RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus），有 A、O、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3和Asia l共7个不同的血清型。

近年来，FMDV的结构和功能尚未完全阐明，而反向遗传学技术则为我们探知病毒提供了一种高效的方法。目前，利用反向遗传学技术不仅成功获得了FMDV的感染性分子克隆，而且还可以运用此项技术研究FMDV的基因结构与功能，病毒复制与表达调控机理、病毒与宿主的相互作用关系等，从而可以应用于病毒防控的研究，基因治疗的研发，新型疫苗的开发等。特别是反向疫苗的研究，为疾病的防控提供了新的方法［1］。总之，反向遗传学技术为FMDV的研究领域开创了一片新天地。

1 不同基因对病毒分子的影响

病毒致病的第一步是病毒与细胞受体结合。对于FMDV细胞受体的研究一直在进行之中，反向遗传学技术为此研究提供了高效的技术支持。Sa-Carvalho D等［2］构建了A12株的嵌合病毒，通过对核衣壳蛋白基因的长度比例不断增加的试验研究发现，FMDV的VP3与硫酸肝素结合可以吸附感染细胞，但需要衣壳表面带正电荷氨基酸残基的参与。Leippert M等［3］在构建了O1K株基因组全长感染性cDNA分子的基础上，将细胞表面整联蛋白受体识别 VP1的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（Arg-Gly－Asp，RGD）RGD三肽基序及其附近引入定点突变，证实在病毒吸附过程中FMDV RGD基序的重要地位。Zhao Q等［4］在构建猪源FMDV感染性cDNA重组基因中，用KGE序列替换了RGD序列，然后将含有此突变位点的P1编码区与牛源FMDV的对等基因置换，获得了嵌合病毒。将嵌合病毒接种猪后，猪产生相应的疾病症状，之后发现基因组中仍保留KGE序列，这表明此FMDV突变株既不利用RGD序列识别受体，又不使用硫酸肝素途径感染细胞，这揭示FMDV至少还有另外一个受体分子。Li P等［5］研究 Asia1型FMDV，分别拯救出了含有RDD（RGD中的G突变为D），RSD（RGD中的G突变为S）与RGD的全长cDNA的病毒。感染动物后发现含有RDD比含有RGD的毒株感染力与致病力高至10倍左右。通过测序表明不同代次的病毒中RGD与RDD稳定存在，这不仅说明了RDD基序可代替RGD进行感染，而且进一步证明了FMDV可能存在另一个受体分子的。

近年来，FMD疫情频繁发生，新的变异株不断出现，且有向全球蔓延的趋势，而基因组的变异往往会影响到病毒毒力、抗原性以及宿主嗜性等多方面的变化。目前，原有的病毒基因型的研究已经不能满足当前对复杂多样的变异株的防控。因而，人们通过反向遗传学技术，找出当今变异株的突变位点，由此可分析出病毒的来源与各地病毒之间的亲缘关系，为FMD的防控奠定了理论基础。Valdazo-Gonzalez B等［6］人应用反向遗传学技术构建出了2011年在保加利亚暴发的FMDV全基因序列，研究此病毒的来源与传播的特点，构建了进化树，由此分析了此病毒的来源以及各地病毒之间的亲缘关系，并且成功的预测了随后将出现的FMDV流行毒株，为FMD多表型遗传谱系的防控提供了基础。在1997年中国台湾暴发的FMD与1999年在中国大陆暴发的FMD的病毒是不同的基因型，在自然状态下，大陆的FMDV毒株仅感染牛羊，而在台湾的FMDV毒株却对猪表现高致病性。后来发现大陆的FMDV毒株在遗传地位上与台湾猪源病毒在一个进化支中［7］。这两次FMD的暴发都严重影响到了畜牧业的发展，也同时造成了巨大的经济损失。

2 新型病毒载体的研究

病毒载体是一种新型的分子生物学工具，可以应用于基因结构与功能的探索、病毒复制与感染的研究，疫苗与基因治疗的开发等［8］。FMDV基因组具有多个稳定表达外源基因的位点并且可控性强，可作为病毒载体。Piccone M E等［9］成功拯救了3株在L蛋白的Lab和Lb之间分别插入流感病毒血凝素HA﹑Flag和Tc标签的FMD重组病毒，经过细胞水平地检测得到拯救病毒外源基因的表达，说明L蛋白的突变并没有影响到细胞中病毒的感染能力与L蛋白的功能，为重组标记毒株的构建提供了新的思路。高度保守的 Arg-Gly-Asp（RGD）基序存在于VP1的G-H环中，G-H环跨度大约是VP1的140～160位的20个氨基酸残基，其环状结构与FMDV的吸附力与抗原性密切相关，在VP1序列中插入外源片段引起人们的关注。Seago J等［10］在 VP1G-H 环中155～156位氨基酸中插入HA与Flag标签，通过蚀斑试验表明含有标签的重组病毒的毒力降低，但可接受蛋白进行融合表达。Lawrence P等［11］将Flag标签成功的插入VP1的G-H环上游区域中，通过蚀斑试验表明插入标签后重组病毒的毒力降低，并且通过免疫荧光检测到外源基因Flag在VP1中的表达。FMDV 3A蛋白影响病毒感染性与嗜性，并且与其他小RNA病毒相比较长，人们一直在探索其自身结构功能以及接受外源基因的能力。LI P等［12］通过研究发现虽然编码3A蛋白N-末端的亲水性区域高度保守，但是，C-末端结构域可以自然地产生不同的缺失，Li等人基于这些特性，推断编码3A蛋白的85～102和133～143的区域对FMDV的复制都是非必需区，并且适合外源基因的插入。研究人员用Flag标签与疱疹病毒（HSV）D蛋白的抗原表位替换了3A中92～102位序列后，成功构建出2株重组病毒。经过免疫荧光法，Western blot和序列分析等检测表明重组病毒与亲本病毒有着相似的毒力与复制动力学。并且，重组病毒在BHK-21细胞中连续传代后仍能稳定地表达，在免疫小鼠后可产生具有诱导标记的特异性抗体。

3 新型口蹄疫生物制品的研制

运用反向遗传学技术对FMDV的研究，都是为了能够更好地了解FMD的暴发，流行途径，从而有效的控制FMD。而如今，新型FMD生物制品的研制为防控疫病的暴发提供了一条有效地途径。

Fowler V L等［13］以 O／C 型的 VP1G-H 环替换A12-119毒株VP1G-H环，构建出了标记疫苗，在接种牛体后发现诱导产生了中和抗体，而且在免疫后21d仍能够完全保护动物免受病毒的攻击。这项研究不仅验证了病毒VP1G-H环在免疫中的重要性而且说明了改变宿主识别位点而构建的嵌合病毒制备的灭活疫苗具有很大的发展空间。Li S等［14］成功拯救出缺失编码3A中91～104氨基酸的FMDV AsiaⅠ型感染性分子克隆，经过动物试验后发现其毒力与复制动力学与亲本病毒相似，但构建的突变病毒只能在BHK-21细胞中复制，在小牛肾细胞中却不能够复制。此试验表明利用反向遗传构建的缺失免疫表位的FMDV突变毒株可作为候选的灭活疫苗避免了常规疫苗毒力返祖的潜在危险，此试验为研制新型弱毒疫苗奠定了基础。

针对新衍生出的多个表型的遗传谱系的病毒间缺乏交叉免疫保护力的这一现象，曹伟军等［15］成功构建出含有预期突变的FMDV O／HN／93株全长cDNA克隆，拯救出了对流行毒具有免疫优势的FMDV O／HN／93株，为研究抗菌谱广的侯选疫苗毒株提供了理论依据。针对FMDV O型毒株中东－南亚拓扑型 （ME-SA）、东南亚拓扑型（SEA）可以被当前疫苗所免疫，而中国拓扑型（CHY）的一些变种难以产生免疫保护作用，给我国猪FMD的防控带来了极大的困难，LI P等［16］构建了一个FMDV疫苗株全长cDNA感染性克隆，并且将抗原位点l、3和4进行了一些氨基酸替换，成功建出新的重组疫苗毒株，发现与野生毒株具有相似的生长特性，且免疫动物后发现，对于传统疫苗不提供保护的变异的CHY型病毒也会产生免疫效应，即重组的疫苗毒株比野生毒株的抗菌谱广，免疫原性好。

目前，有学者构想在FMDV感染性cDNA分子的基础上插入其他病毒的抗原序列，生产出双价苗，可以一苗防两病。Tong W等［17］用FMDV VP1处141aa-160aa 和 200aa-213aa 处 的 序 列 替 换 了PRRSV-HuN4-F112（猪繁殖与呼吸综合征病毒）NSP2处508aa-532aa对应的基因，并将构建的全长cDNA克隆转染BHK-21细胞36h后，将收集的细胞培养液上清接种至单层Marc-145细胞中出现明显的CPE现象并重新获取重组病毒。将拯救的病毒通过免疫荧光鉴定表明外源基因成功的在该病毒中表达。经过测验发现获救的重组PRRSV的滴度与其直接亲本病毒rHuN4-F112-delta 508aa-532aa相似，但比rHuN4-F112高。Jeeva S等［18］提出了用猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的复制子载体表达FMDV结构蛋白。他们构建了含有FMDV P1-2A、3C基因的PRRSV K418DM的复制子载体，经电击转化入MARC-145细胞（非洲绿猴肾上皮细胞）。使用针对FMDV P1-2A、3C和PRRSV N的单克隆抗体对体外所表达出的蛋白进行免疫荧光检测，证实了相关蛋白的分泌表达。

张晓霞等［19］成功构建了抗FMDV单链抗体cDNA T7噬菌体展示文库，此文库的成功构建为FMD的快速诊断提供了一条新的途径。Uddowla S等［20］构建了一个安全的FMD负标记疫苗平台，构建了多株多点突变和多片段缺失的FMDV感染性分子克隆，将多株成功拯救出的病毒免疫动物后，一方面发现与亲本病毒比较，毒力存在一定程度的下降，这为目前FMD灭活疫苗的生产提供一种新型的替代毒株。另一方面，免疫动物后诱导产生的抗体，可以区分不同毒株，这为目前ELISA检测FMD提供了一个新的﹑更加准确的辅助材料。

4 结语

如今虽然人们对于FMDV的结构与功能、病毒与宿主的相互作用及致病机理等有了一定的了解，但是还存在许多不清楚的地方，特别是基因组中不同结构共同影响病毒毒力与感染性等方面还未深入的研究，而反向遗传学为此方面的研究提供了技术支持。当前，应用反向遗传学将外源基因插入FMDV的研究证实FMDV有作为病毒载体的潜质，有关方面的探索被越来越多的学者所关注。现阶段小片段插入FMDV基因的研究已经取得了一些进展，但较大的外源片段插入的研究还相对滞后，需要更进一步的研究。与此同时，依赖于反向遗传学研发新型疫苗，可能会为FMD的防控提供一种更加高效的方法。FMDV与其他病毒抗原序列的结合生产出的双价苗，一苗防两病为高效疫苗的开发提供了一种新的思路。不仅如此，针对近几年不断出现的新的变异株，人们通过反向遗传学技术不仅研制出抗原谱广的、免疫原性好的候选疫苗毒株，而且还成功的推测了将要产生的变异毒株。这无疑为控制FMD疫情的发生与流行提供了最佳的方法。当前人们正在试图确认反向遗传疫苗遗传的稳定性与工业生产的可行性，并且正在不断开发新的高效的反向遗传疫苗。毋庸置疑，反向遗传学的兴起，极大地推动了FMDV的研究并对FMD疫情防控起到举足轻重的作用。

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Advance in Reverse Genetics Technology of Foot-and-mouth Disease Virus

REN Fang1，YI Zhong1，GUO Hui-ling1，WEI Yu-rong1，MA Wen-ge1，HUANG Jiong1

（1.InstituteofVeterinaryMedicine，XinjiangAcademyofAnimalScience，Urumqi，Xinjiang，830000，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China）

Foot-and-mouth disease（FMD）is an infectious disease caused by foot-and-mouth disease virus（FMDV）.Office International Des Epizooties（OIE）has listed foot-and-mouth disease as the first disease of the most important animal epidemic diseases.If FMD breaks out，it shall seriously affect the development of animal husbandry，and the national economy.But now，we still have the blind spot for the footand-mouth disease virus＇s understanding.There are many insufficiencies for the foot-and-mouth disease vaccine.The rapid development of viral reverse genetics technology has provided one new and effective technical method for the research of the foot-and-mouth disease virus structure and the research of the new vaccine and biological preparations.This article reviewed the domestic and foreign research of FMDV molecular pathogenic mechanism and the new FMD vaccine preparation by reverse genetics technology，at last prospected the new trend of foot-and-mouth disease virus reverse genetics.

Foot-and-mouth disease virus；infectious cDNA clone；reverse genetics

S852.659.6

A

1007-5038（2014）11-0084-04

2014-02-21

农业部公益性行业（农业）科研专项（201103008）

任 方（1989－），女，新疆乌鲁木齐人，硕士研究生，从事动物病毒病研究。＊通讯作者