5味中药对体外培养原代人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响

于爽，武昕，姜英，赵向宇

（中国医科大学1.附属第一医院中心实验室；2.附属第一医院妇科；3.基础医学院生物化学与分子生物学研究室，沈阳110001）

·论著·

5味中药对体外培养原代人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响

于爽1，武昕2，姜英2，赵向宇3

（中国医科大学1.附属第一医院中心实验室；2.附属第一医院妇科；3.基础医学院生物化学与分子生物学研究室，沈阳110001）

目的利用原代培养的人外阴正常皮肤成纤维细胞，观察中药对人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响。方法胰蛋白酶消化、分离及培养人外阴皮肤成纤维细胞；倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态；HE染色观察细胞爬片下的形态及着色；免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白；测定细胞生长曲线；MTT法测定莪术、黄芪、丹参、川穹及当归5种中药作用后细胞增殖能力。结果生长曲线测定结果显示：传6代内以及传6代内复苏人外阴皮肤成纤维细胞增殖能力均很强。MTT检测结果显示：5种药物在特定浓度范围内均能抑制人外阴皮肤成纤维细胞的增殖。分别作用于人外阴皮肤成纤维细胞72 h后，莪术5、10、100 mg/L浓度组，黄芪500、1 000 mg/L浓度组，丹参1 000 mg/L浓度组，川穹500、1 000 mg/L浓度组，当归100、500、1 000 mg/L浓度组均显示抑制增殖作用，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中莪术和川穹的抑制强度呈剂量依赖性。结论成功建立了体外人外阴皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定方法；特定浓度范围内的莪术、黄芪、丹参、川穹和当归能够抑制人外阴皮肤成纤维细胞的体外增殖。

成纤维细胞；细胞增殖；中药

人皮肤成纤维细胞具有较强的自我更新能力，是皮肤损伤后的主要修复细胞［1］。活力增强的人皮肤成纤维细胞可以引起皮肤的硬化［2］，成纤维细胞分泌胶原蛋白的异常与外阴硬化性苔藓的病变形成有关。目前，中药治疗外阴硬化性苔藓虽然有一定的效果，但疗效不确切，药物作用的分子机制尚不清楚。因此，本研究拟探讨中药对外阴皮肤成纤维细胞的增殖的影响，旨在研究中药是否能逆转外阴硬化性苔藓的病变，为该病的中药治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本：外阴正常皮肤2块，来源于中国医科大学附属第一医院妇科行外阴整形术切除的皮肤组织，切除后迅速进行处理。

1.1.2 试剂：四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于Sigma公司；二型胶原酶购于Invitrogen公司；波形蛋白抗体购于BioGenex公司；即用型SABC试剂盒购于BOSTER公司；中药莪术、黄芪、丹参、川穹、当归购自中药店。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养：外阴正常皮肤2块，每块2 cm×3 cm，用含抗生素的PBS反复漂洗去除脂肪。将漂洗后的外阴皮肤组织剪成0.5 cm×1.5 cm大小的条形，置于含2 mg/mLⅡ型胶原酶消化液的离心管中，4℃过夜。次日，用无菌剪刀和镊子分离表皮与真皮，弃表皮，留真皮，使用0.25%的胰蛋白酶反复吹打消化，用含血清的DMEM/F12培养基清洗，1 200 r/min离心8 min，弃上清，按1×105/mL细胞浓度用10%牛血清的DMEM/F12培养液培养。待细胞贴壁，观察细胞生长情况并进行传代和换液。

1.2.2 倒置显微镜下观察细胞形态：培养48 h后，倒置显微镜下观察细胞，记录照相。

1.2.3 HE染色：收集培养到第3代的成纤维细胞，以2×105/mL的密度行细胞爬片。培养24 h后使用PBS充分漂洗，进行常规HE染色，中性树胶封片。

1.2.4 免疫组织化学染色检测波形蛋白：将分离得到的原代人外阴皮肤成纤维细胞以2×105/mL的密度进行爬片培养。待细胞爬至玻片40%～60%时，取出玻片，PBS漂洗。4﹪多聚甲醛处理20 min，PBS漂洗，血清封闭，滴加即用型鼠抗人波形蛋白一抗，4℃过夜。PBS漂洗后滴加山羊抗小鼠IgG二抗37℃孵育20 min；滴加SABC试剂37℃孵育20 min；DAB显色30 s，苏木素复染，显微镜观察。

1.2.5 测定细胞生长曲线：分别将培养第2代和第6代的人外阴皮肤成纤维细胞消化，调节细胞浓度至2×104/mL，按每孔1 mL接种到24孔培养板进行培养，每隔24 h收集3孔细胞，分别计数求均值，连续记录7 d后，绘制细胞生长曲线。

1.2.6 测定冻存细胞生长曲线：将培养第2代和第6代的成纤维细胞常规冻存于液氮。4周后复苏，调节细胞浓度2×104/mL，按每孔1 mL接种到24孔培养板进行培养。每隔24 h收集3孔细胞，分别计数求均值，连续记录7 d后，绘制细胞生长曲线。

1.2.7 实验药物的制备：将中药莪术、黄芪、丹参、川穹和当归分别加6倍量水煎2次，每次2 h。双层纱布过滤并合并药液，浓缩后使用95%乙醇等体积沉淀，取上清，旋转蒸发回收乙醇，活性炭脱色3次，滤器过滤除菌后调节pH至7.0。根据生药的质量和最终药物提取液的体积计算药液浓度（g/mL），作用于细胞培养时均用无血清培养基稀释到相应终浓度（5、10、100、500、1 000 mg/L）。

1.2.8 细胞增殖抑制率的检测（MTT法）：取对数生长期细胞胰酶消化并将细胞浓度稀释为2×104/mL，每孔加100 μL细胞悬液接种于96孔培养板中，5% CO2、37℃培养箱中培养24 h后，更换为100 μL无血清培养基继续培养24 h。每孔加入100 μL含不同浓度药物的培养基稀释液，培养72 h后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，孵育4 h。将液体吸出后每孔加入100 μL二甲基亚砜，振荡混匀，酶联免疫检测仪于492 nm处比色，结果以A值表示，并计算细胞增殖率（proliferation rate，PR）=A/A0× 100%，每孔至少重复6次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 倒置显微镜下人外阴皮肤成纤维细胞的形态（图1）

原代培养的人外阴皮肤成纤维细胞约在培养3～5 d时进入对数生长期。镜下观察细胞大多呈长梭形。细胞生长旺盛时在倒置显微镜下排列成簇状。

2.2 HE染色细胞形态学观察（图2）

图1 倒置显微镜下成纤维细胞的形态×20Fig.1 Morphology of fibroblasts observed under inverted microscope×20

图2 人外阴皮肤成纤维细胞HE染色×20Fig.2 HE staining of human vulvar skin fibroblasts×20

HE染色后，人外阴皮肤成纤维细胞在光镜下呈多角形和长梭形，细胞核较大，圆形或椭圆形，并呈现淡蓝色。

2.3 免疫组织化学法检测波形蛋白（图3）

波形蛋白免疫组化染色显示：原代人外阴皮肤成纤维细胞胞质着染，呈棕黄色。

图3 人外阴皮肤成纤维细胞波形蛋白免疫组织化学染色×20Fig.3 Immunohistochemical staining of vimentin in human vulvar skin fibroblasts×20

2.4 生长曲线测定结果（图4）

生长曲线显示：原代人外阴皮肤成纤维细胞的倍增时间较短，在特定时间段内细胞数量与培养时间呈正相关；传代后的成纤维细胞与原代细胞比较，具有同样的增殖能力，原代培养第2及第6代细胞的增殖能力与冻存复苏后的同代次细胞比较，无明显差异。结果显示：由于复苏成活率的影响，冻存复苏后的成纤维细胞潜伏期内有负增殖，但在第2～3天又表现出较强的增殖能力。

图4 人外阴皮肤成纤维细胞生长曲线Fig.4 Growth curve of human vulvar skin fibroblasts

2.5 MTT检测结果

如表1所示：莪术在低浓度组（5、10 mg/L）和中浓度组（100 mg/L），黄芪在高浓度组（500、1 000 mg/L），丹参在高浓度组（1 000 mg/L），川穹在高浓度组（500、1 000 mg/L），当归在中浓度组（100 mg/L）和高浓度组（500、1 000 mg/L）可以抑制人外阴皮肤成纤维细胞的增殖，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。莪术和川穹的抑制作用呈剂量依赖性。黄芪在低浓度组（10 mg/L）和中浓度组（100 mg/L），当归在低浓度组（5、10 mg/L）显示促进增殖作用，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），此2种药物的促增殖作用均呈现剂量依赖性；其他受试组浓度对人外阴皮肤成纤维细胞的增殖无影响。

3 讨论

人皮肤成纤维细胞具有较强的自我更新能力，作为皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞，能够产生大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，从而发挥作用。研究表明，永生化的人皮肤成纤维细胞可以作为自体细胞基因治疗的可靠靶细胞［3］。人体腹部皮肤、包皮组织以及动物皮肤的成纤维细胞体外分离、原代培养已有相关研究［4～6］，然而人外阴皮肤成纤维细胞的分离、原代培养及鉴定尚未见报道。成纤维细胞具有稳定的生物学特性，包括细胞形态、标志蛋白等。成纤维细胞大多呈大多角形和扁平星形，波形蛋白作为成纤维细胞的一种标志蛋白［7］，不同于肌细胞的桥连蛋白，也不同于上皮细胞的角蛋白，是鉴定成纤维细胞的特异标志。

表1 5种中药对原代人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响Tab.1 Effects of five herbs on the proliferation of primary human vulvar skin fibroblasts

本研究采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化法体外分离培养人外阴皮肤成纤维细胞，通过生长曲线的测定以及生物学特性的验证确定成纤维细胞体外分离培养成功。生长曲线显示：分离得到的成纤维细胞在体外经过潜伏期、细胞增殖、对数生长以及平台期。传代后的成纤维细胞显示出与原代细胞基本相同的增殖能力。虽然冻存复苏后的细胞在潜伏期内与未冻存细胞比较略呈现负增殖，但是在有限的传代次数内仍显示较强的增殖力。

莪术为姜科植物莪术和温郁金的根茎，研究表明莪术能够抑制肿瘤细胞、晶状体上皮细胞以及人胚肺成纤维细胞的增殖［8～10］。因其具有行气破血、消积止痛的功效，我国民间用莪术治疗肿瘤具有悠久的历史。本研究通过MTT法检测了莪术对人外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响，结果显示：5、10、100 mg/L浓度组莪术具有抑制细胞增殖的作用，且在此浓度范围内抑制强度与药物浓度呈现剂量依赖性；高浓度组（500、1 000 mg/L）莪术对人外阴皮肤成纤维细胞无明显影响，与对照组比较无明显差异。研究证实，莪术对晶状体上皮细胞的抑制作用可能与细胞内游离Ca2+浓度升高有关，其作用通过介导的Ca2+-PKC信号通路实现［9］，提示莪术抑制人外阴皮肤成纤维细胞增殖的作用机制可能也与此有关。

中药丹参和川芎具有活血化瘀的功效，研究证实其不仅能抑制成纤维细胞的增殖［11］，还可以抑制成纤维细胞合成胶原［12］，发挥抗纤维化作用。本研究结果表明，低浓度组的丹参和川穹对体外建立的人外阴皮肤成纤维细胞的增殖没有明显影响，其中丹参仅在最高浓度（1 000 mg/L）时具有抑制作用；川穹则在500、1 000 mg/L浓度显示出剂量依赖性抑制作用。然而丹参和川穹的抗纤维化以及抑制成纤维细胞增殖的作用机制尚不清楚，可能与抑制促纤维化因子以及激活细胞外基质若干降解酶的活性等有关［13］。

黄芪多糖和当归挥发油作为中药黄芪和当归的主要有效成分，分别具有益气生肌和活血化瘀等功效。研究表明，黄芪多糖和当归挥发油可以影响不同组织成纤维细胞的增殖、代谢以及大分子化合物的合成［14，15］。本研究结果表明，高浓度组的黄芪（500、1 000 mg/L）和中高浓度组当归（100、500、1 000 mg/L）可抑制人外阴皮肤成纤维细胞增殖，低中浓度组的黄芪（5、10、100 mg/L）和低浓度组的当归（5、10 mg/L）可促进人外阴皮肤成纤维细胞的增殖。

综上所述，本研究首次成功分离培养了人正常外阴皮肤成纤维细胞，建立了一种稳定、快速高效的成纤维细胞的分离培养体系，对于后续以永生化的人外阴皮肤成纤维细胞作为靶细胞的研究具有重要意义。并且探讨了不同浓度5种常见中药对此正常外阴皮肤成纤维细胞增殖的影响，对于皮肤成纤维细胞的异常增殖以及相关疾病的治疗具有一定的临床指导意义。

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（编辑 王又冬）

EffectsofFive Herbson the invitro Proliferation ofPrimary Human Vulvar Skin Fibroblasts

YUShuang1，WUXin2，JIANGYing2，ZHAOXiang-yu3
（1.Central Laboratory，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Gynecology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo establish a method for culturing of primary human vulva skin fibroblasts，assess the effects of several Chinese herbs including Rhizoma zedoariaeon，Astragalus membranaceus，Salvia miltiorrhiza，Szechwan lovage rhizome and Angelica sinensis on theinvitroproliferation of primary human vulva skin fibroblasts and preliminarily explore the mechanism for the treatment of lichen sclerosus et atrophicus.MethodsHuman vulva skin fibroblasts were cultured aftertrypsin digestion.The morphology ofthe fibroblasts was observed underinverted and electron microscope，also by HE staining.Immunohistochemical staining was performed to observe the vimentin in fibroblasts.The proliferation of fibroblasts was determined by growth curve and MTT assay.ResultsPrimary human vulva skin fibroblasts were obtained and cultured after trypsin digestion.The morphology and biologicalcharacteristics ofthis obtained fibroblastswere verified by inverted and electron microscope observation and HE，immunohistochemical staining.The proliferative ability of the fibroblasts was high within 6 passages after cryopreservation.All of the Chinese herbs could inhibit the proliferation of the obtained fibroblasts at appropriate concentrations.After cultured in medium with different drugs for 72 h，Rhizoma zedoariaeon at the concentration 5，10，100 mg/L，Astragalus membranaceus at the concentration 500，1 000 mg/L，Salvia miltiorrhiza at the concentration 1 000 mg/L，Szechwan lovage rhizome at the concentration 500，1 000 mg/L and Angelica sinensis at the concentration 100，500，1 000 mg/L showed a inhibition effect on the proliferation of fibroblasts，along with significant differences compared with controls.In addition，the effect of Rhizoma zedoariaeon and Szechwan lovage rhizome present a dose-dependent manner.ConclusionThe method forin vitroculture of primary human vulva skin fibroblasts is successfully established.Rhizoma zedoariaeo，Astragalus membranaceus，Salvia miltiorrhiza，Szechwan lovage rhizome and Angelica sinensiscan inhibitthe proliferation ofthe obtained fibroblasts atappropriate concentrations.

fibroblast；cell proliferation；traditional Chinese medicine

R285.5

A

0258-4646（2014）10-0865-05

国家自然科学基金（30973190）

于爽（1984-），女，技师，本科.

武昕，E-mail：xinwu.1964@aliyun.com

2014-06-03

网络出版时间：