Yes相关蛋白对人脑胶质瘤干细胞增殖的促进作用

包义君，王鹏飞，官彦雷，王维，张路阳，仇波，吴安华，王运杰

（中国医科大学附属第一医院神经外科，神经外科研究所，沈阳110001）

Yes相关蛋白对人脑胶质瘤干细胞增殖的促进作用

包义君，王鹏飞，官彦雷，王维，张路阳，仇波，吴安华，王运杰

（中国医科大学附属第一医院神经外科，神经外科研究所，沈阳110001）

目的探讨Hippo信号传导通路下游转录共激活子Yes相关蛋白（YAP）在人脑胶质瘤干细胞中调控作用。方法利用FACS分选得到CD133-和CD133+细胞，利用PCR和Western blot法检测2组细胞间YAP表达的差异；利用小发夹RNA干扰CD133+细胞中YAP的表达，通过MTT法分析YAP干扰表达后人脑胶质瘤干细胞增殖情况。结果YAPmRNA和蛋白在CD133+细胞中表达明显高于CD133-细胞；YAP干扰表达后CD133+细胞增殖能力减弱。结论YAP参与人脑胶质瘤干细胞的功能调控，对人脑胶质瘤干细胞的增殖起到促进作用。

Yes相关蛋白；增殖；人脑胶质瘤干细胞

人脑胶质瘤是人类最常见颅内原发恶性肿瘤，尤其是多形性胶质母细胞瘤，即便经手术、放疗和替莫唑胺化疗等综合治疗，预后仍然较差，5年存活率仅10%，而且易于复发［1］。人脑胶质瘤干细胞是胶质瘤发生和复发的根源，具有自我更新、无限增殖、向亲本肿瘤细胞分化及引起肿瘤发生等特点，能抵抗放疗和化疗。因此探索胶质瘤干细胞及其调控机制，对于胶质瘤的治疗具有重要意义。

Hippo信号传导通路可通过调节细胞增殖和凋亡调控器官体积，在干细胞功能、肿瘤发生及组织再生等方面发挥重要调节作用［2～5］。其下游转录共激活子Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）可在上游激酶作用下经过磷酸化调控，进而在细胞核内外穿梭，在细胞核内可结合各种转录因子参与细胞功能调控。YAP能与多种转录因子结合调节胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞和肿瘤干细胞特性［4，6］。尽管YAP在胶质瘤中内源性表达并可促进胶质瘤细胞增殖［7～9］，但在胶质瘤干细胞中的作用尚无报道。我们的研究结果表明，YAP能够参与人脑胶质瘤干细胞的调控，并对胶质瘤干细胞的增殖起到明显的促进作用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及材料

胎牛血清、DMEM/F12培养液（美国Gibco公司），B-27无血清和维生素A添加物、重组人表皮细胞生长因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）和重组人纤维母细胞生长因子b（recombinant human fibroblast growth factor-b，rhFGF-b，美国Invitrogen公司），鼠抗人CD133/2-PE（德国Miltenyi公司），兔抗人YAP多克隆抗体（#4912，美国Cell Signaling公司），兔抗人α-actin多克隆抗体（美国Abcam公司），YAP小发夹RNA（small hairpin RNA，shRNA）（sc-38637-SH）、对照shRNA（sc-108060）（美国Santa Cruz公司）。

1.2 人脑胶质瘤干细胞分选和培养

手术切除人脑胶质瘤新鲜组织标本20例，在PBS中进行破碎，经酶消化后再经过巴氏管抽吸分离，过滤得到单细胞悬液，在无血清DMEM/F12/B-27/rhEGF/rhFGF-b的干细胞培养条件下悬浮培养过夜以利于细胞表面抗原恢复，利用CD133抗体标记，然后流式细胞仪（FACS Vantage，美国BD公司）分选得到CD133+细胞，即人脑胶质瘤干细胞。

1.3 肿瘤细胞球形成实验

人脑胶质瘤干细胞单细胞悬液在超低吸附细胞培养皿中干细胞培养条件下培养，定期补充EGF和bFGF，观察肿瘤细胞球的形成和体积大小，即人脑胶质瘤干细胞的增殖能力。

1.4 实时荧光定量PCR

取CD133-和CD133+细胞加入TRIzol 1 mL打成匀浆，依次以氯仿、异丙醇、乙醇、DDW等抽提RNA，紫外分光光度计测定后逆转录为cDNA，利用ABI PRISM 7500 Fast Real-time PCR system进行扩增分析。PCR反应条件如下：95℃3.5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃45 s，扩增40个循环，4℃终止反应。利用标准曲线法对目的基因的表达进行定量分析。序列如下：YAP上游：CAGCACAGCAAATTC TCCAA，下游：TGGATTTTGAGTCCCACCAT；内对照Actin上游：CCCAGCACCATGAAGATCAAGATC，下游：CCTGCTTGGTGATCCACATCTGC。

1.5 Western blot法

CD133-和CD133+细胞回收后经过裂解液（25 mmol/L Tris-HCl pH7.4，100 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，10%甘油，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L Na3VO4，5 mmol/L ZnCl2，100 mmol/L NaF，10 mg/mL抑肽酶，1 mg/mL亮肽素，1 mmol/L PMSF）中超声裂解，经蛋白定量后，取100 μg蛋白上样，经10%分离胶电泳分离后，转膜至硝酸纤维素膜上，利用YAP抗体和α-actin抗体孵育后清洗，二抗孵育后曝光显影。

1.6 shRNA转染

将YAP shRNA和对照shRNA质粒按照Lipofectamine 2000使用说明转染到CD133+细胞中，并通过Western blot检测内源性YAP蛋白的干扰效率。

1.7 MTT法

人脑胶质瘤干细胞单细胞悬液于超低吸附细胞培养皿中悬浮培养后形成肿瘤细胞球，按照培养天数回收细胞球，经酶消化后制成单细胞悬液，加入MTT溶液温育后离心，待细胞贴壁后，加入二甲基亚砜，然后利用酶标仪检测光密度值，判断分析胶质瘤干细胞的增殖能力。

1.8 统计学分析

利用SPSS 13.0统计分析软件，采用单因素方差分析进行数据分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人脑胶质瘤干细胞的分离

CD133被认为是人脑胶质瘤干细胞的一个重要的表面标志物，尽管有文献报道CD133-细胞也形成肿瘤细胞球和在免疫缺陷鼠中产生肿瘤，但是Brescia等［10］研究表明CD133对于维持胶质瘤干细胞的特性具有重要作用，因此在我们的研究中将CD133+细胞群作为胶质瘤干细胞进行研究。我们将手术切除得到的人脑恶性胶质瘤肿瘤标本制成单细胞悬液，在干细胞培养条件下过夜培养后，利用CD133标记后FACS分选，得到CD133-和CD133+细胞群（图1A）。将CD133-和CD133+细胞在干细胞培养条件下进行培养时，发现尽管CD133-细胞也可以形成较小的肿瘤细胞球，但是CD133+细胞在同等条件下形成肿瘤细胞球的能力更强（图1B），而且连续传代仍可形成肿瘤细胞球，表明我们分离得到的CD133+细胞具有肿瘤干细胞的增殖和自我复制特性。同样，利用CD133+细胞得到的肿瘤细胞球消化后进行贴壁培养，该细胞可以分化为神经胶质细胞和神经元细胞。

2.2 YAP在人脑胶质瘤干细胞中的表达

Hippo信号传导通路下游转录共激活子YAP参与干细胞的调控，但在胶质瘤干细胞中的作用尚无报道，我们希望探讨YAP在人脑胶质瘤干细胞中的作用。PCR的检测结果（图2A）表明YAPmRNA在CD133+细胞（人脑胶质瘤干细胞）中表达明显升高；Western blot的结果（图2B）同样表明YAP内源性蛋白在人脑胶质瘤干细胞中的表达相对于CD133-细胞明显升高。这一结果表明，YAP参与了人脑胶质瘤干细胞的调控作用。

2.3 YAP干扰表达对人脑胶质瘤干细胞增殖具有抑制作用

为了进一步分析YAP在人脑胶质瘤干细胞中的作用，我们利用shRNA技术干扰YAP的蛋白表达，通过MTT法分析YAP在人脑胶质瘤干细胞增殖中的作用。首先，我们通过Western blot检测YAP shRNA的干扰效率，图3A结果表明YAP shRNA能够明显干扰内源性YAP的蛋白表达。我们利用YAP shRNA干扰以及对照shRNA干扰的CD133+细胞（人脑胶质瘤干细胞）进行肿瘤细胞球形成实验，并分析干细胞的增殖能力，图3B结果提示YAP shRNA干扰后人脑胶质瘤干细胞的增殖能力明显下降，图3C提示肿瘤细胞球的大小有明显差别。这一结果说明YAP参与了人脑胶质瘤干细胞增殖能力的调控，并促进人脑胶质瘤干细胞的增殖。

图1 人脑胶质瘤干细胞分选及肿瘤细胞球的形成Fig.1 Sorting of human brain glioma stem cells and formation of tumor sphere

图2 YAP mRNA和蛋白在人脑胶质瘤干细胞中的表达Fig.2 The mRNA and protein expression of YAP in human brain glioma stem cells

3 讨论

作为原发于颅内的恶性肿瘤人脑胶质瘤，尤其是多形性胶质母细胞瘤，即便经过综合治疗，其中位生存期仍然仅有14.6个月，5年存活率仅10%，容易复发［1］。人脑胶质瘤干细胞被认为是胶质瘤发生和复发的根源，因此探讨胶质瘤干细胞的调控机制，并寻找可行的作用靶点对于胶质瘤的治疗具有重要意义。关于人脑胶质瘤干细胞的肿瘤标志物一直存在争议，但是CD133作为一种重要的标志物已被接受，虽然CD133-细胞液可以形成肿瘤细胞球，但是CD133+对于维持胶质瘤干细胞特性具有重要意义［10］。因此，在本实验中我们利用CD133标记后FACS分选得到CD133-和CD133+细胞进行相关实验。

Hippo信号传导通路的研究近年来十分活跃，该传导通路进化过程高度保守，在哺乳动物中由三部分组成［2］：（1）上游调节因子，如NF2等；（2）核心部分，包括丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶如LATS等及衔接蛋白如MOB等；（3）下游转录共激活子，包括YAP及TAZ。Hippo信号通路在激活状态下，细胞经膜蛋白受体感受胞外生长抑制信号，经胞内激酶复合物磷酸化级联反应，激活的LATS磷酸化YAP（主要是丝氨酸127位点）和TAZ（主要是丝氨酸89位点），磷酸化的YAP和TAZ滞留胞质内而不能进入胞核行使转录激活功能。反之，失活状态下YAP和TAZ进入核内，与TEAD和SMAD等多种转录因子结合，调控基因表达。

图3 YAP干扰表达能够抑制人脑胶质瘤干细胞的增殖Fig.3 YAP interference inhibits the proliferation of human brain glioma stem cells

YAP在肿瘤发生及干细胞调控方面也得到广泛的研究。YAP在人乳癌、肝癌、肺癌等［3，5］肿瘤组织中蛋白表达升高，在脑胶质瘤中也有表达［7～9］，能促进肿瘤细胞增殖。在干细胞功能调控方面，YAP能与TEAD、SMAD和RUNX等多种转录因子结合，调节包括肿瘤干细胞在内的干细胞自我更新、增殖和分化［4，6］。YAP在人脑胶质瘤干细胞中是否具有调控作用尚未见报道，因此在本研究中我们希望探索YAP在人脑胶质瘤干细胞中的调节作用。

我们利用CD133分选获得CD133+细胞（人脑胶质瘤干细胞），并通过YAP shRNA干扰CD133细胞中内源性YAP蛋白的表达，肿瘤细胞球形成实验以及MTT的分析结果都表明YAP能够促进人脑胶质瘤干细胞的增殖特性。至于YAP是否能够同样调控人脑胶质瘤干细胞自我更新、分化等其他干细胞特性尚待进一步研究。

［1］Stupp R，Hegi ME，Mason WP，et al.Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phaseⅢstudy：5-year analysis of the EORTC-NCIC trial［J］.Lancet Oncol，2009，10（5）：459-466.

［2］Bao Y，Hata Y，Ikeda M，et al.Mammalian Hippo pathway：from development to cancer and beyond［J］.J Biochem，2011，149（4）：361-379.

［3］Zhao B，Tumaneng K，Guan KL.The Hippo pathway in organ size control，tissue regeneration and stem cell self-renewal［J］.Nat Cell Biol，2011，13（8）：877-883.

［4］Liu H，Jiang D，Chi F，et al.The Hippo pathway regulates stem cell proliferation，self-renewal，and differentiation［J］.Protein Cell，2012，3（4）：291-304.

［5］Chan SW，Lim CJ，Chen L，et al.The Hippo pathway in biological control and cancer development［J］.J Cell Physiol，2011，226（4）：928-939.

［6］Hiemer SE，Varelas X.Stem cell regulation by the Hippo pathway［J］.Biochem Biophys Acta，2013，1830（2）：2323-2334.

［7］Fernandez-L A，Northcott PA，Dalton J，et al.YAP1 is amplified and up-regulated in hedgehog-associated medulloblastomas and mediates Sonic hedgehog-driven neural precursor proliferation［J］. Genes Dev，2009，23（23）：2729-2741.

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［10］Brescia P，Ortensi B，Fornasari L，et al.CD133 is essential for glioblastoma stem cell maintenance［J］.Stem Cells，2013，31（5）：857-869.

（编辑 陈姜）

Promotion Effectof Yes-associated Protein on the Proliferation ofHuman Brain Glioma Stem Cells

BAOYi-jun，WANGPeng-fei，GUANYan-lei，WANGWei，ZHANG Lu-yang，QIUBo，WUAn-hua，WANGYun-jie
（DepartmentofNeurosurgery，The FirstHospital，The Institute ofNeurosurgery，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the role of Yes-associated protein（YAP），which is the downstream co-activated factor of Hippo pathway，on the proliferation ofhuman brain glioma stem cells.MethodsFACS sorting was applied to obtain the CD133-and CD133+cells.The mRNAand protein expressions of YAP were examined by real-time fluorescence polymerase chain reaction and Western blot，separately.YAP of CD133+cells was then knocked down by shRNA and the proliferation was determined by MTT assay.ResultsThe expressions ofYAPmRNA and protein in CD133+cells were higher than that in CD133-cells.YAP interference inhibited the proliferation of human brain glioma stem cells.ConclusionYAP is involved in the regulation ofhuman glioma stem cells，which promotesthe proliferation ofglioma stem cells.

Yes-associated protein；proliferation；human brain glioma stem cells

R739.41

A

0258-4646（2014）11-0986-05

辽宁省博士科研启动基金（20111095）；教育部留学回国人员科研启动基金（教外司留［2013］1792号）

包义君（1975-），男，副教授，博士.

王运杰，E-mail：wangyunjie024@vip.sina.com

2014-09-29

网络出版时间：