分子印迹仿生光子晶体的制备及其在己烯雌酚检测中的应用

赛娜，吴蕴棠，孙忠，高志贤，黄国伟，*

（1.天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，天津300070；2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所天津市环境与食品安全监控技术重点实验室，天津300050）

分子印迹仿生光子晶体的制备及其在己烯雌酚检测中的应用

赛娜1，吴蕴棠1，孙忠1，高志贤2，*，黄国伟1，*

（1.天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，天津300070；2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所天津市环境与食品安全监控技术重点实验室，天津300050）

探讨分子印迹仿生光子晶体的制备及其在己烯雌酚残留检测应用的可行性。方法采用悬浮聚合法、垂直沉降法等方法制备出性能稳定的分子印迹仿生光子晶体。结果分子印迹仿生光子晶体对己烯雌酚残留最低响应浓度为10 ng/mL，并展现出较高的响应特异性。结论将分子印迹技术与光子晶体结合可发展出一种高性能检测材料，即分子印迹仿生光子晶体，不仅具有制备简单、制备材料低廉等优势而且具有较高的检测性能。

己烯雌酚；分子印迹；仿生光子晶体；响应

己烯雌酚（diethylstibestrol，DES）是一种雌性激素，在医学临床上普遍用于妇科病的治疗，如子宫炎、流产等。随着其生产性能不断提高，己烯雌酚也在畜牧、水产养殖业中得到了广泛的应用。而从1971年起，人们逐渐发现己烯雌酚残留对人体存在一系列的毒副作用，如长期食用含有己烯雌酚残留的牛肉会引起幼女早熟，甚至还可能引发癌症[1-2]。因此，世界各国和卫生组织逐渐开始关注己烯雌酚残留控制，并将己烯雌酚列为食品性动物中禁止使用的兽药。然而，在强大经济利益的驱使下，滥用己烯雌酚的现象依然存在。目前检测己烯雌酚的方法有免疫法、色谱法等[3-4]。尽管这些方法具有高灵敏度，高特性等检测特点，但也存在一些不足，如设备昂贵，过程复杂，操作繁琐等。因此，发展一种简单、易行、成本低、高灵敏度的检测方法十分必要。

光子晶体是一种介电常数在空间呈周期性变化的材料，由于其具有可控制光传播方向的特性而使得它在传感器，临床诊断，生物医学等诸多方面有着广阔的应用前景。自1997年Asher等开发了新型光子晶体化学智能传感材料以来，响应不同外界环境（甲基对硫磷，Pb2+，Cu2+，肌氨酸酐，葡萄糖等）的光子晶体材料的研究工作逐渐展开。他们采用对丙烯酰胺凝胶光子晶体中添加冠醚功能化的方法制备了检测Pb2+和Cu2+的传感器[5-7]。但是利用这种方法设计一个对特定目标具有传感性能的材料时，必须寻找一种特殊的识别单元（例如：抗体对抗原的识别，冠醚对金属离子的识别等），然而并不是每一个目标分子都能找到如此成熟的识别单元与之相匹配[8]。

本文以己烯雌酚作为检测目标物，将分子印迹技术引入到光子晶体的骨架结构中，以建立一种新的光学检测方法，并尝试提出“分子印迹仿生光子晶体”这一概念。该材料可将分子印迹聚合物对己烯雌酚的特异性识别过程通过光子晶体光学性能变化进行传导表达，进而达到操作简便、快速且灵敏的残留物检测目的。

1 材料和方法

1.1 材料

己烯雌酚购自北京普天同创生物科技有限公司。甲基丙烯酸甲酯（MMA），过硫酸钾（KPS）等常用化学试剂均购自天津大学科威公司。恒温水箱购自华北分析仪器厂。光纤光谱仪HL-2000购自美国OCEANOPTICSS公司。环境扫描电镜ESEMXL30购自Phillips公司。

1.2 方法

1.2.1 分子印迹PMMA微球制备

称取35mg己烯雌酚加入1.5mLMMA中，于室温下震荡1 h后于冰箱（4℃）中静置过夜，使己烯雌酚与MMA充分作用。将上述混合液与13mL去离子水混合于四口烧瓶中。加入0.03 g的KPS作为引发剂到上述混合液中，氮气的保护下80℃水浴搅拌（300 r/min）反应。反应结束后将所制得的乳液冷却至室温，离心后用去离子重新震荡超声分散，重复5次后将所得的己烯雌酚印迹PMMA颗粒分散在去离子水中进行保存。

在对照实验中，采用上述相同的制备了非印迹的PMMA微球，区别在仅于制备微球反应液中不含有己烯雌酚。

1.2.2 分子印迹仿生光子晶体的制备

将10mL己烯雌酚分子印迹PMMA微球乳液与140mL去离子水混合，超声分散35min。用来生长光子晶体的载玻片用浓硫酸：H2O2（v/v=7∶3）浸泡处理过夜，再用去离子水冲洗，氮气吹干后放入玻璃器皿中，将分散好的己烯雌酚印迹PMMA微球倒入玻璃器皿中，放置在恒温恒湿箱内。5 d后即可得到分子印迹仿生光子晶体。按同样方法制备非印迹光子晶体，区别在使用非印迹PMMA微球乳液。

1.2.3 分子印迹仿生光子晶体的固定与模板分子洗脱

将固定膜的一面紧贴于己烯雌酚印迹仿生光子晶体表面，使其完全贴合。然后缓慢剥离固定膜。此时，己烯雌酚印迹仿生光子晶体以反转入固定膜表面。用冰乙酸和甲醇混合液（v/v=1∶20）溶液反复冲洗修饰后的固定膜，以洗掉模板分子（己烯雌酚），直至洗脱液中检测不到模板分子，再用甲醇冲洗固定膜，以洗去过量的冰乙酸，最后浸泡于去离子水中保存。

1.2.4 检测程序

将修饰后的固定膜另一面反贴于检测池内，附有敏感层（分子印迹仿生光子晶体）的一面与检测液接触。在检测池内加入2mL缓冲液作为背景溶液，移入隔光箱内，将光谱光源探头浸没于液面以下，设置检测参数。待光学性能稳定后，加入不同浓度的己烯雌酚溶液，观察相应出现一系列光波变化。

1.2.5 紫外光谱分析

取一系列5mL离心管，分别配制0.04mmol/L己烯雌酚，0.04mmol/LMMA以及其混合溶液4℃冰箱中静置过夜后扫描吸收光谱并在适当波长下测得吸光度。

1.2.6 表征方法

紫外-可见吸收光谱仪以测试雌二醇印迹仿生光子晶体的Bragg衍射光谱；Phillips ESEM-XL30对己烯雌酚印迹仿生光子晶体表面形态进行分析；TLL-C台式速冻冷冻离心机用以对颗粒进行分离纯化。

2 结果与分析

2.1 己烯雌酚与MMA间相互作用

研究分子间作用力的分析技术有紫外光谱、红外光谱和核磁共振等方法，其中紫外光谱法因其设备简单，操作方便，成为研究分子印迹组分作用力的重要的分析方法。将己烯雌酚和功能单体（MMA）混合前后紫外信号进行比较，以了解己烯雌酚与功能单体间的相互作用。

模板分子和单体乙腈混合液紫外吸收叠加值，即理论值之和的最大吸收峰值，与模板分子和单体乙腈混合液的紫外洗漱峰值差别越大，说明该功能单体与模板分子的相互作用越强[9]。从180 nm～350 nm范围扫描的UV谱图中发现谱图吸收带发生变化的范围集中在短波190 nm~300 nm之间，故研究了这一波段波谱的变化。紫外分光光度法研究结果如图1所示。

图1 己烯雌酚对MMA相互作用紫外光光谱图分析Fig.1 Thespectrogramsof the interaction between DESand MMA

结果表明己烯雌酚和单体混合前后的吸光度值均发生了变化，说明己烯雌酚与MMA在体系中发生了相互作用。因此，MMA适作为用于己烯雌酚检测的分子印迹聚合单体。

2.2 分子印迹仿生光子晶体形态特征

从图2a中可以看到，分子印迹仿生光子晶体正面具有紧密堆积的结构和较好的周期习惯，空位缺陷较少，结构十分规整。同时，从微球缺失的孔洞中（红色框内）可以推断出，该光子晶体为面心立方结构。Woodcock[10]等曾提出，在球模型中，小球堆积成面心立方结构要比堆积成六角密堆结构结构时的能量低0.5RT/mol，因此面心立方结构是一种最为稳定的堆积结构。由此可见，该分子印迹仿生光子晶体具有较为稳定的晶体结构。从图2b中，可以得出分子印迹仿生光子晶体具有在可视范围内明亮而单一的结构色。当光通过光子晶体材料，将发生强烈的衍射效应从而出现衍射峰。其衍射峰波长的位置为572 nm，如图2c。

图2 分子印迹仿生光子晶体的（a）SEM图片，（b）结构色图，（c）光谱图Fig.2（a）SEMiMages，（b）optical response，and（c）reflection spectruMof themolecular imprinted bionic photonic crystal

2.2 检测特性

2.2.1 检测灵敏度

图3展示了分子印迹仿生光子晶体和非印迹仿生光子晶体对于溶液中己稀雌酚浓度的响应。从图2中可以得知，分子印迹仿生光子晶体可随着溶液中己烯雌酚含量的变化发生光学性能的改变。其最低响应浓度为1 0 ng/mL。而同时，非印迹光子晶体对目标分子没有明显响应，其Bragg衍射峰强度基本没有降低。因此我们可以确定，该材料的检测性源于乙烯雌酚印迹所致。

图3 分子印迹仿生光子晶体和非印迹光子晶体对己烯雌酚的响应对比图Fig.3 Plotsof the Bragg shiftof theMolecular iMprinted bionic photonic crystaland thenon-imp rinted bionic photonic crystal with diethylstibestrolat various concentrations.

2.2.2 检测特异性

特异性对于检测方法来说是一项重要指标，在检测过程中检测物的结构类似物不可避免的存在，因此除了分析待测物在分子印迹仿生光子晶体上的响应，还要分析己烯雌酚结构类似物在分子印迹仿生光子晶体上的响应。在一系列相同浓度条件下，分别测定它们在传感器上的响应性（表1）。

表1 分子印迹仿生光子晶体对不同目标分子的选择性Table1 Optical responseof themolecular imp rinted bionic photonic crystal to other analogues

3 结论

将分子印迹技术引用于光子晶体中，可发展出一种全新的残留检测材料——分子印迹仿生光子晶体。该材料可将分子印迹对目标物的识别过程通过光子晶体本身的光学性能变化而展现，不仅拓宽了光子晶体的应用范围，而且对污染物的检测方法提供了新的思路。

[1]Veurink M,Koster M.The history of DES,lessons to be learned[J]. PharmacyWorld and Science,2005,27：139-143

[2]Reuvers T,Perogordo E,Jiménez R.Rapid screeningmethod for the determination ofdiethylstilbestrol in edibleanimal tissue by column liquid chromatography with electrochemical detection[J].Journalof chromatography：biomedicalapplication,1991,564(2)：477-484

[3]Williams A T,Winfield A T,BelloliR C.DESderivatization of anabolic agentswith high-performance liquid chromatographic separation and fluorescence detection[J].Chromatogr A,1982,240(1)：224-229

[4]陈德坤,郑增忍,曲志娜.己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备[J].中国兽医学报,2004,24(4)：364-366

[5]Alexeev V L,Das S,Finegold D N,et al.Photonic crystal glucose-Sensingmaterial for noninvasivemonitoring of glucose in tear fluid [J].ClinicalChemistry,2004,50(12)：2353-2360

[6]Asher SA,Alexeev V L,Goponenko A V,etal.High ionic strength glucose-sensing photonic crystal[J].Journalof the American ChemicalSociety,2003,125：3322-3329

[7]Asher SA,Peteu SF,Reesev CE,etal.Polymerized crystalline colloidalarray chemical-sensingmaterials for detection of lead in body fluids[J].Analyticaland BioanalyticalChemistry,2002,373(7)：632-638

[8]Hu X B,An Q,LiG T,etal.Imprinted photonic polymers for chiral recognition[J].Angewandte Chemie International Edition,2006,45 (48)：8145-8148

[9]卢春阳,何海成,马向霞,等.除草剂青莠定分子印迹聚合物的合成及结合性能研究[J].化学学报,2004,62(8)：799-803

[10]Woodcock LV.Entropy Differencebetween the face-centered cubic and hexagonal close-paked crystal structures[J].Nature,1997,385：141-143

The Fabrication of Molecular IMprinted Bionic Photonic Crystal for the Detection of Diethylstilbestrol

SAINa1，WUYun-tang1，SUN Zhong1，GAOZhi-xian2，*，HUANGGuo-wei1，*
（1.DepartmentofNutrition and Food Hygiene，Schoolof Public Health，Tianjin MedicalUniversity，Tianjin 300070，China；2.Tianjin Key Laboratory ofRisk Assessmenfand Control Technology for Environmentand Food Safety，Institute ofHealth and EnvironmentMedicine，Tianjin 300050，China）

Molecular imprinted bionic photonic crystals was synthesized and applied in the detection of diethylstilbestrol residues.Molecularimprinted bionic photonic crystalswith high performanceswere fabricated by thesuspensionpolymerizationand theverticalsettlement.Molecular imprinted bionic photonic crystalsshowed the high sensitivity（as low as10 ng/mL）and specificity.Based on the combination ofmolecular imprinting technique with photonic crystals，a high-performance detectionmaterials，namelymolecularly imprinted bionic photonic crystal，canbedeveloped，exhibitingnotonlysimple，inexpensivepreparationbutalsohighdetectionperformance.

diethylstibestrol；molecular imprinting；bionic photonic crystal；response

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.020

2014-09-15

国家自然科学基金青年科学基金项目（81302430）；中国博士后科学基金面上资助项目（2014M560192）；天津市高等学校科技发展基金（20110143）

赛娜（1983—），女（蒙古），讲师，博士，研究方向：营养与食品卫生学。

*通信作者：黄国伟（1962—），男（汉），教授，博士，研究方向：营养与食品卫生学。高志贤（1966—），男（汉），研究员，博士，研究方向：营养与食品卫生学。