产1,3-丙二醇克雷伯氏菌诱变菌株的发酵动力学研究

桂妍雯

兰州交通大学化学与生物工程学院 （甘肃兰州 730070）

技术进步

产1,3-丙二醇克雷伯氏菌诱变菌株的发酵动力学研究

桂妍雯

兰州交通大学化学与生物工程学院 （甘肃兰州 730070）

克雷伯氏菌是1,3-丙二醇（1,3-PD）生产菌。根据产酸克雷伯氏菌的诱变菌株Y-37的发酵过程曲线，对克雷伯氏菌生产1,3-PD的发酵动力学特性进行研究，提出了发酵过程中菌体生长、1,3-PD生物合成、甘油消耗的动力学模型，并应用matlab数值应用软件对实验数据进行拟合。该模型基本上能够描述克雷伯氏菌的发酵过程，模型的计算值与实验测定值能够比较好地拟合。

克雷伯氏菌 1,3-丙二醇 动力学分析

1,3-丙二醇（1,3-PD）主要用于生产聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）。PTT作为一种新型的纤维材料，具有优异的回弹性、染色性、抗污性，较好的抗紫外线变色性能以及不易起静电、吸水较少等特点，主要用于制造地毯、工程塑料、膜及纺织业的服装材料等，因此1,3-PD的发展空间巨大，是目前研究的热点。而随着绿色工业的发展，用微生物法生产1,3-PD将成为研究的主要方向。迄今为止，国内外对微生物生产1,3-PD的研究主要集中在培养基及发酵工艺优化方面，而对其发酵特性、发酵动力学研究的报道较少。本研究对克雷伯氏菌分批发酵生产1，3-PD的动力学进行了分析，建立了分批发酵过程的动力学模型。

1 材料与仪器

1.1 菌种

实验室自选克雷伯氏菌的诱变菌株Y-37。

1.2 试剂

磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠、硫酸亚铁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化锂、氯化亚铁、氯化铁、葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸三钠、乙醇、甘油、1,3-PD，分析纯；牛肉膏、酵母浸粉、琼脂，BR生物试剂。

1.3 仪器

分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）、电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］、托盘天平（北京大栅栏天平厂）、可调式电热板（北京市永光明医疗仪器厂）、手提式压力蒸汽灭菌锅（山东新华安得医疗用品有限公司）、立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、离心机（上海安亭科学仪器厂）、气相色谱仪（日本岛津分析仪器有限公司）、填充柱（北京迪马科技有限公司）、冷冻恒温振荡器（太仓市实验设备厂）、洁净工作台（上海博迅实业有限公司）、冰箱展示柜（澳柯玛股份有限公司）、CO2厌氧培养箱、紫外诱变箱。

2 实验内容及方法

2.1 种子活化

将试管种子划线接种至种子活化平板上，30℃培养18～20 h。

2.2 种子培养

在250 mL三角瓶中装入50 mL种子培养液，接入单菌落，在摇床转速180～200 r/min、37℃的条件下培养14～16 h。

2.3 分析测定方法

2.3.1 菌体量的测定

菌体质量浓度的测定采用分光光度法，以蒸馏水做空白，在650 nm波长下测发酵液的吸光度值（A650）。

2.3.2 发酵液残余甘油及1,3-PD产量的测定

发酵液中的甘油、1,3-PD及其副产物的质量浓度都可以通过气相色谱仪进行测定。检测设备为1490高效气相色谱仪，色谱柱为填充柱，长2 m，内径3 mm，柱温210℃，汽化室温度280℃，检测器温度260℃，载气为N2，压力100 kPa，空气压力40 kPa，氢气压力60 kPa，进样量1 μL。

将发酵液以4 800 r/min的转速离心20 min后取上清液，将上清液用孔径为0.2 μL的膜进行过滤，最后将其在上述条件下进行气相检测。测得各物质的出峰面积，利用标准液所测得的峰面积及其质量浓度所对应的标准曲线进行计算。

3 结果与讨论

3.1 发酵动力学曲线

对诱变菌株Y-37进行发酵试验，绘制Y-37发酵过程的动力学曲线，见图1。图中描述了菌体量、1,3-PD和残余甘油质量浓度随发酵时间的变化情况。可以看出，诱变菌株Y-37的菌体生长曲线比较典型，其与残余甘油曲线在细胞生长期间基本呈镜像关系。在发酵的初始阶段菌株的生长比较缓慢，1,3-PD的产量也较低。但是随着菌体的生长进入对数期时，甘油被大量消耗，1,3-PD逐渐积累，发酵至第三天时，菌体生物量达到最大。在发酵后期，由于1,3-PD的逐渐积累对细胞的生长起到了抑制作用，发酵结束后菌体生物量A650为4.83，1,3-PD的质量浓度为31.76 g/L。

图1 诱变菌株发酵罐分批发酵过程曲线

3.2 发酵动力学模型

发酵动力学是对发酵过程中各状态参数随时间变化规律的研究，发酵动力学模型的建立，对于发酵工艺条件的研究、反应过程的操作优化以及系统、有效地控制发酵过程具有重要的理论研究意义，而且为小罐实验数据的放大提供理论依据，体现其实际应用价值。建立发酵动力学的主要目的是更加深刻地了解微生物复杂的代谢过程和本质，通过建模的形式寻找最合适的操作条件，以期实现发酵过程的最优化控制，为工业生产提供理论依据。发酵动力学模型一般由三部分组成，包括菌体生长动力学模型、产物形成动力学模型以及底物消耗动力学模型。

3.2.1 菌体生长动力学模型的建立

Monod方程是现代微生物生长动力学研究的理论基础，是描述菌体生长最常用的模型。该模型是一种最简单、典型的决定论均相非结构模型，通过下列假设建立：（1）如果菌体的生长为均衡型非结构式的生长，细胞的成分只需要用菌体质量浓度一个参数表示即可；（2）如果培养基中仅有一种物质为生长限制性底物，那么其他营养成分对微生物的生长不产生影响；（3）将微生物的生长看作简单反应，并假设菌体得率为常数，没有动态滞后。可见，Monod方程并不能完全反应微生物的生长规律，仅适用于细胞生长比较缓慢和细胞密度比较低的环境。一般情况下，Monod模型在描述菌体生长过程中不宜使用，而Verhulst-Pearl提出的Logistic equation（逻辑斯谛方程，又称阻滞方程）对拟合菌体生长过程具有适用性，常用于描述单细胞生长动力学。Logistic模型的特点是菌体细胞开始增长缓慢，而在以后某一范围内迅速增长，达到某限度后，增长又缓慢下来，是典型的S型曲线,能真实反映间歇发酵过程中因菌体增长而抑制自身生长的现象。

Monod方程：

式中：μmax——菌体的最大比生长速率，h-1；Ks——Monod饱和常数，mmol/L；S——基质质量浓度，mmol/L；X——菌体质量浓度，g/L。

Logistic方程：

式中：Xmax——菌体最大质量浓度值，g/L。

由甘油发酵生产1,3-PD的发酵过程曲线可以看出，微生物的生长呈现明显的S型，因此，本实验采用Logistic方程来拟合菌体的生长。

3.2.2 1,3-PD形成动力学模型的建立

产物是指在细胞培养过程中代谢底物生成的除细胞生物量以外的物质。为了便于研究其形成过程，Garden根据产物的形成和菌体生长的内在关系将产物的形成分成3类：（1）产物形成与菌体生长偶联型：产物只产生于菌体生长阶段；（2）产物形成与菌体生长部分偶联型：部分产物形成于菌体生长阶段，而当菌体处于生长稳定期时形成部分或者大部分的产物；（3）产物形成与菌体生长非偶联型：只要细胞存在，就会有产物生成。通用于这三种情况的模型一般用Luedeking-Piert方程来表示，该模型对于描述微生物代谢产物的生成普遍适用，它将产物生成率看作菌体生长量和菌体生长率的函数，用表达式可以表示为：

式中：α——与菌体生长率相关联的产物合成常数；β——与菌体生长量相关的产物合成常数；x——菌体；p——产物；rx——菌体的比生成速率；rp——产物的比合成速率。

按不同的α和β常数值，可以将上述产物的合成动力学基本分成以下三种类型：当α＞0，β＝0时，为生长偶联型；当α＞0，β＞0时，为部分生长偶联型；当α＞0，β＜0时，为非生长偶联型。

对于利用甘油发酵生产1,3-PD的过程，实验所用菌株Y-37在细胞生长的对数期和稳定期，1,3-PD的合成都在进行，且产物的合成与基质的消耗成正比。因此，利用甘油生产1,3-PD的发酵过程属于部分生长偶联型，可用表达式（4）表示：

3.2.3 底物消耗动力学模型的建立

底物是指细胞生长必需的各种营养物质，根据基质的平衡原理，主要包括三个方面的消耗，首先用于细胞的生长，主要用于增加细胞；其次用于维持细胞的代谢，最终合成代谢产物；第三，用于维持细胞的基本生命活动。底物消耗的动力学模型可用公式（5）表示：

式中：Yx/s——碳源菌体生长得率常数，g/g；Yp/s——碳源产物生成的得率常数，g/g；mx——微生物细胞维持常数，g/(L·d)。

一般情况下，微生物细胞的碳源维持系数数值都很小，为使模型更简化，可将菌体呼吸所消耗的基质归结在菌体生长消耗之内，将利用甘油进行分批发酵生产1,3-PD过程中的限制性基质消耗分为菌体细胞消耗和产物积累消耗两部分，因此基质（甘油）消耗的模型方程可简化成表达式（6）：

3.3 模型求解

根据公式（1）、（4）、（6），分别对图1中的发酵菌株生长曲线、1,3-PD生成曲线和甘油消耗曲线进行拟合。根据实验测得的数据，利用Matlab模型拟合工具包对确定的1,3-PD发酵动力学的模型参数运用非线性曲线进行拟合，将标准的麦夸特算法与通用全局优化法相结合，且使参数与误差的平方和最小，采用全局优化的算法，通过收敛迭代的方法最后找出参数的最佳估计值，结果如表1所示。

表1 1,3-PD发酵生产动力学模型参数估计值

诱变菌株Y-37的β值趋于0，α值为77.8，由此表明克雷伯氏菌诱变菌株Y-37的1,3-PD发酵机制也是产物的形成与细胞的生长相偶联。将上述模型参数估计值代入动力学方程，最终得到克雷伯氏菌发酵生产动力学模型为：

（1）菌体生长动力学模型

（2）1,3-PD生成动力学模型

（3）底物消耗动力学模型

3.4 模型拟合分析

由微生物代谢的本质和经验建立发酵动力学模型。一个好的数学模型需要经过实践的不断验证，在实践中对拟合参数进行反复修正，才能更好地反映微生物细胞的发酵本质。本实验采用标准麦夸特法与通用全局优化法相结合方式，以收敛迭代法求取最优估计参数，拟合参数结果见图2～4。

由模型拟合值与实验测定值的统计分析可知，实验所构建的克雷伯氏菌发酵动力学模型，除个别点外，所建模型与克雷伯氏菌细胞生长及l,3-PD生成过程中的实验数据能较好地吻合，因此可以作为克雷伯氏菌发酵生产1,3-PD优化控制的参考依据。

图2 克雷伯氏菌细胞质量浓度测定值与模型值拟合曲线

图3 甘油质量浓度测定值与模型值拟合曲线

4 结论

图4 1,3-PD质量浓度测定值与模型值拟合曲线

（1）通过对克雷伯氏菌发酵过程曲线的分析可知，克雷伯氏菌Y-37菌体生长会达到最大饱和质量浓度；1,3-PD属于次级代谢产物，1,3-PD的合成与细胞生长呈现部分相关。

（2）根据发酵过程所测实验数据，选取合适的动力学模型，并通过分析软件对模型参数进行非线性拟合。模型可表述为：（1）菌体生长动力学模型：dX/dt=0.78X(1-X/5.43)；（2）1,3-PD生成动力学模型：dP/dt=77.8dX/dt+0.007X；（3）底物消耗动力学模型：-dS/dt=13.158(dX/dt)+1.205(dP/dt)。

该模型基本上能够描述克雷伯氏菌的发酵过程，模型的计算值与实验测定值能够比较好地拟合。因此，可以用于预测发酵过程中1,3-PD的产量，从而可以对发酵操作参数提出要求，初步实现发酵过程的优化与控制。

Research on Fermentation Kinetics of Klebsiella Pneumoniae Mutant Strains for Producing 1,3-Propanediol

Gui Yanwen

Klebsiella pneumoniaeis the strain for producing 1,3-propanediol(1,3-PD).According to the fermentation curve of Y-37,the mutant strain of Klebsiella oxytoca,researched the fermentation kinetics characteristics ofKlebsiella pneumoniaeduring 1,3-PD production,put forward the kinetic model of cell growth,biosynthesis of 1,3-PD and consumption of glycerin in the fermentation process,and fitted the experimental data by numerical software matlab.The model could basically describe the fermentation process of Klebsiella pneumoniae,and the data calculated by the model fairly matched the experimental data.

Klebsiella pneumoniae;1,3-Propanediol;Kinetic analysis

（略）

TQ223.16+2

2014年6月

桂妍雯女1987年生硕士助教研究方向：微生物酶技术