基于颜色判定的LAMP 方法快速检测结核分枝杆菌

刘威 李奉京 黄留玉 袁静

1 中国人民解放军疾病预防控制所 （北京 100850）

2 北京蓝谱生物科技有限公司 （北京 100027）

结核分枝杆菌(Mycobacterium. tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～4×0.4μm，牛分枝杆菌则比较粗短。据WHO 统计，全世界约每3 个人中就有1 个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。2010 年，有880 万人罹患结核病，140万人死于结核病（WHO，2010）。我国是世界上22 个结核病高负担国家之一，约三分之一的人口已感染了结核分枝杆菌，受感染人数超过4亿。人感染结核后，治疗周期长，药物毒副作用大，而且耐药及多重耐药菌株的出现，给结核病患者的治疗带来很大困难。因此，建立快速、特异、灵敏的检测方法是当今结核病诊断和治疗的迫切需要，也是结核病疫情发生后，对密切接触者进行早期诊断、隔离、治疗，防止更多人员感染的前提。

目前，显微镜下观察仍是很多国家沿用的结核分枝杆菌检测手段（WHO，2008），但灵敏度低，需要对病人进行多次采样，反复检测。与此相比，痰培养检测的敏感性提高了100 倍[1]，同时也因其高度的特异性，是目前结核病诊断的金标准。然而在临床上，结核分枝杆菌在培养基上生长缓慢，使用传统的罗氏培养基培养所需时间长达1～2 个月[2]。因此在全世界与结核病的斗争中，寻找一种简单、快速、高效的诊断方法仍是一个关键性的问题。基于分子技术的PCR 方法在一定程度上解决了上述问题[3,4]，虽然该方法在灵敏度和特异性方面都有所提高，但整个检测过程仍需要5-6 个小时，且该方法需要专业的技术人员、特定的实验区域、精密的温度控制来进行开展。此外，有人将巢式PCR、实时PCR 等方法应用于结核分枝杆菌的快速检测中[5,6]，虽然提高了灵敏度，但是检测过程复杂，而且需要昂贵的仪器设备，仍不能满足简单、快速的要求。

环介导的恒温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸等温扩增技术[7]，其原理是：针对目的保守靶基因上的六个区域设计4 条引物，在链置换型DNA 聚合酶（Bst DNA polymeras）的作用下，60～65˚C 的恒温条件下，在60min 内即可大量合成目标基因，同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生，如果同时加入两条环引物，还可以促进目标片段的扩增，大大提高反应速度。由于LAMP 技术只有在特异的六个独立区域同时识别的情况下才能发生反应，所以这种方法具有很高的特异性。另外，整个反应在恒温条件下发生，不需要复杂的仪器设备即可开展检测，而且反应在1 个小时内结束，大大节约了实验时间。因此，LAMP 方法在多种细菌的检测中已经发挥了巨大作用[8～11]。本研究通过LAMP 方法对结核分枝杆菌的IS6110 基因进行快速检测，建立了一种新的结果判断方法，并对特异性和灵敏度进行了评价。

1.材料与方法

本研究所用结核分支杆菌菌株来自中国人民解放军第309 医院结核病研究所，所用试剂为日本荣研的LAMP 法DNA 扩增试剂盒，仪器为日本荣研的实时浊度基因检测系统LA-320c；DNA模板的提取采用Chelex 法。

2.LAMP 引物的设计

从NCBI 中获得结核病保守基因IS6110 序列（GenBank ID：CP002992.1），利用软件Primer design V4（http://primerexplorer.jp/e/）设计LAMP引物（内引物FIB 和BIP、外引物F3 和B3、环引物LF 和LB），共设计5 套引物，经过比较扩增效率选择最佳引物组合。

3.LAMP 反应

LAMP 反应体系按照试剂盒说明书进行，用实时浊度基因检测系统LA-320C 实时监测反应过程，并在反应液中加入钙黄绿素荧光染料，以便通过颜色变化进行结果判定，首先筛选出最佳引物，之后进行特异性和灵敏度实验。

4.结核杆菌LAMP 特异性检测

收集脑膜炎奈瑟氏菌（NM29019），肺炎链球菌（SP112-07），军团菌（LP9135），流感嗜血杆菌（M5216），肺炎克雷伯杆菌（46117），副溶血弧菌（5474），肠炎沙门氏菌（50326-1），甲型副伤寒沙门菌（86423），福氏志贺氏菌（4536），宋内志贺氏菌（2531），肠侵袭性大肠杆菌（44825），致病性大肠杆菌（2348），肠产毒性大肠杆菌（44824）菌株，分别提取DNA，与结核杆菌DNA 一起进行LAMP 反应，以检测结核杆菌LAMP 方法的特异性，并同时通过实时浊度基因检测系统和钙黄绿素荧光法进行结果判定。

实验结果表明，只有结核杆菌菌株可发生LAMP 反应（图1），产生大量焦磷酸镁白色沉淀，反应液浊度上升，用实时浊度基因检测系统检测则表现为曲线上升。其他对照组并没有产生沉淀，没有发生反应，表示该方法具有较好的特异性。

如果在反应前加入1µl 钙黄绿素，可以根据颜色变化判断反应是否发生了LAMP 反应（图2），绿色表示待测样品中存在结核杆菌（阳性），橙色表示待测样品中不存在结核杆菌（阴性）。

图1. LAMP 引物特异性实验；1：阴性对照双蒸水；2：结核分枝杆菌；3：脑膜炎奈瑟氏菌（NM29019）；4：肺炎链球菌（SP112-07）；5：军团菌（LP9135）；6：流感嗜血杆菌（M5216）；7：肺炎克雷伯杆菌（46117）；8：副溶血弧菌（5474）；9：肠炎沙门氏菌（50326-1）；10：甲型副伤寒沙门菌（86423）；11：福氏志贺氏菌（4536）；12：宋内志贺氏菌（2531）；13：肠侵袭性大肠杆菌（44825）；14：致病性大肠杆菌（2348）；15：肠产毒性大肠杆菌（44824）。

图2. JH164 特异性实验钙黄绿素染色结果；1：阴性对照双蒸水；2：结核分枝杆菌；3：脑膜炎奈瑟氏菌（NM29019）；4：肺炎链球菌（SP112-07）；5：军团菌（LP9135）；6：流感嗜血杆菌（M5216）；7：肺炎克雷伯杆菌（46117）；8：副溶血弧菌（5474）；9：肠炎沙门氏菌（50326-1）；10：甲型副伤寒沙门菌（86423）；11：福氏志贺氏菌（4536）；12：宋内志贺氏菌（2531）；13：肠侵袭性大肠杆菌（44825）；14：致病性大肠杆菌（2348）；15：肠产毒性大肠杆菌（44824）。

5.结核杆菌LAMP 方法灵敏度检测

以结核分支杆菌为检测对象，提取其总DNA，定量后将总DNA 进行10 倍梯度稀释，使得最终稀释浓度为1010ng/µl、101ng/µl、10.1ng/µl、1.01ng/µl、101pg/µl、10.1pg/µl、1.01pg/µl、0.101pg/µl，进行LAMP 反应。同时以稀释的DNA 为模板，以F3 和B3 为引物，进行PCR 检测，反应体系为：1µL 模板、引物各12.5pmol、12.5µL 2×Taq MIX，灭菌ddH2O 补足至25µL。取10µL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，进行结果观察。

从实验结果可以看出，用实时浊度检测系统检测和钙黄绿素检测结果相同，LAMP 最低检测浓度为101pg/µl（图3 和图4）。PCR 反应产物是184bp，最低检测浓度为1.01ng/µl（图5），结果表明结核分枝杆菌LAMP 检测法比普通PCR 检测方法的灵敏度高10 倍。

图3. 结核杆菌LAMP 方法灵敏度实时浊度基因检测系统观察结果；1-8 模板浓度分别为：1010ng/µl、101ng/µl、10.1ng/µl、1.01ng/µl、101pg/µl、10.1pg/µl、1.01pg/µl、0.101pg/µl。

图4. 结核杆菌LAMP 方法灵敏度荧光染料观察结果；1-8 模板浓度分别为：1010ng/µl、101ng/µl、10.1ng/µl、1.01ng/µl、101pg/µl、10.1pg/µl、1.01pg/µl、0.101pg/µl。

图5. 结核杆菌PCR 方法灵敏度结果；1-8 模板浓度分别为：1010ng/µl、101ng/µl、10.1ng/µl、1.01ng/µl、101pg/µl、10.1pg/µl、1.01pg/µl、0.101pg/µl。

6.讨论

目前，寻找一种更加实用的结核分枝杆菌检测方法仍然是全世界所面临的问题。自2000 年发明了环介导等温扩增法后[7]，该方法以其高效、快速、简单等优势，在众多临床疾病的诊断[12,13]、流行性细菌或病毒的定性定量检测[14～16]等方面得到了广泛的应用。LAMP 方法检测结核分枝杆菌继承并发展了PCR 方法的优点。

LAMP 方法具有较高的检测灵敏度、特异度和较快的反应速度。本研究中LAMP 最低检测浓度为101pg/µl，而普通PCR 方法仅能检测到1.01ng/µl，表明结核分枝杆菌的LAMP 检测法比普通PCR 检测方法的灵敏度高10 倍，这就意味着对细菌含量较少的痰标本进行检测时，LAMP方法同样适用。另外3 对引物的同时使用，大大提高了LAMP 方法的特异性和反应速度。虽然在本研究中理想的检测反应时间为50-60min，但一般在30min 左右即可观察反应结果，加上样本前处理时间，一般在70min 之内就可以得出反应结果。

此外LAMP 方法还具有简单、价廉的优点。LAMP 反应实现了核酸的等温扩增，整个反应只需将温度控制在60˚C～65˚C 即可，大大扩展了检测范围。目前有的研究者运用电泳或者在反应完成后添加SYBR Green I 荧光染料来判断反应结果，这种方法都使反应产物暴露于空气中，极易造成假阳性，而且电泳法检测LAMP 反应并不能实时反映LAMP 反应过程。本研究中采用实时浊度基因检测系统和钙黄绿素检测，将整个反应和检测融合为一个过程，而且反应完成后不开盖，很好地杜绝了污染, 有效防止了假阳性。近年来，有学者报道了另外一种基于LAMP 检测结核分枝杆菌的方法，这种方法叫做RT-LAMP-ELISA 混合淡化技术[17]，这种方法虽然具有高度的敏感性，但是成本较高，不适宜推广应用。

作为一种新的检测方法，LAMP 以其简单、快速、特异性强、灵敏度高等特点，给结核分枝杆菌的快速检测提供了新的思路，尤其对各级疾控中心和基层医疗机构筛查或快速检测具有重大的意义。

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