离子色谱法测定果汁中乳酸、富马酸、柠檬酸的含量

王昌钊，郭婕，吴双民，李仁勇

[1.陕西出入境检验检疫局，西安 710068； 2.西安市粮油质量检验中心，西安 710003； 3.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，北京 100080]

有机酸存在广泛，种类繁多，是影响果汁口感和风味的重要物质。果汁中有机酸含量的高低与果汁产品品质有密切的关系［1］，同时也受到生产技术和加工工艺的影响。乳酸是评价果汁产品质量的一项重要指标。在乳酸菌的作用下，果汁中的碳水化合物发酵生成乳酸。富马酸一般是在合成苹果酸的过程中产生，因此若苹果汁中含有富马酸，则有可能添加合成苹果酸。过度的加工条件也可能产生富马酸，例如果汁浓缩过程中，苹果酸受热就会生成富马酸。因此相同条件下生产的鲜榨苹果汁往往比浓缩苹果汁含有较少的富马酸。苹果汁中柠檬酸的含量同样也具有重要的特征和意义，当其超出一定的值(RSK值)，则表示该果汁是掺假苹果汁。因此一些进口国对苹果汁中的有机酸提出了比较严格的要求，如欧盟果蔬汁饮料协会(AIJN)［2］规定苹果汁中乳酸的含量不得超过0.5 g／L (11.2 Brix)，富马酸的含量不得超过5.0 mg／L(11.2 Brix)，柠檬酸的含量应在50～150 mg／L之间，其它一些国家也有类似规定。

有机酸的分析方法通常有极谱法［3］、容量法［4–5］、分光光度法［6–8］、气相色谱法［9–10］、高效液相色谱法［11–15］、离子色谱法［16–20］等。农业部标准《果汁测定方法 乳酸的测定》是试样经脱糖氧化后蒸馏，用碘量滴定法测定［4］。《果汁测定方法 柠檬酸的测定》则是将有机酸以钡盐形式分离以后，利用柠檬酸与重氮化磺胺酸的特效反应，利用分光光度法比色测定［6］。以上检测步骤繁琐，所用试剂较多，花费时间过长。高效液相色谱法虽可以同时测定乳酸、柠檬酸、富马酸，但由于有机酸没有末端吸收，需要长时间稳定紫外检测器，且方法的分离度和灵敏度偏低，在实际样品分析时乳酸分离效果并不理想。离子色谱仪配备抑制型电导检测器，检测有机酸的灵敏度较高，因此笔者采用离子色谱法测定了果汁中的乳酸、柠檬酸、富马酸，测定结果准确可靠。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

离子色谱仪：Dionex ICS–5000型，附带Chromeleon工作站，美国赛默飞公司；

淋洗液发生罐：EGC–KOH Ⅲ型，美国赛默飞公司；

乳酸、富马酸、柠檬酸：优级纯，天津市科密欧化学试剂开发中心；

OnGuard II RP固相萃取小柱：1.0 mL，美国赛默飞公司；

浓缩苹果汁、浓缩梨汁：陕西出口产品；

实验用水为超纯水(电阻率不小于18.2 MQ·cm)。

1.2 色谱条件

色谱柱：Dionex IonPac AS19型(250 mm×4 mm，美国赛默飞公司)；保护柱：IonPac AG19型(250 mm×4 mm，美国赛默飞公司)；流动相：氢氧化钾溶液，梯度淋洗，氢氧化钾溶液浓度0～15 min为2 mmol／L，15～30 min为2～40 mmol／L，30～40 min为40 mmol／L，40～43 min为2 mmol／L，流量为1 mL／min；抑制器：连续自动再生膜阴离子抑制器；检测方式：抑制型电导检测器(配ASRS 300型微膜电抑制器，自循环电抑制，抑制电流为99 mA)；柱温：30℃，进样体积：25 μL。

1.3 标准溶液的配制

有机酸混合标准溶液：称取一定量的乳酸、富马酸、柠檬酸，用超纯水配成1 000 mg／L的混合标准溶液，其中乳酸的浓度是混合标准溶液经加热回流15 h后，以氢氧化钠标准溶液进行标定所得。

1.4 样品的制备

果汁样品的制备：准确量取6 mL样品(精确至0.05 mL)置于50 mL容量瓶中，用超纯水稀释定容到标线，摇匀后过0.22 μm尼龙滤膜和On-guard II RP固相萃取小柱(小柱使用前分别用5 mL甲醇和10 mL去离子水以2 mL／min的流速活化)，弃去3 mL初滤液，续滤液收集后进样分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱及淋洗条件的选择

苹果汁中3种待测有机酸成分中，乳酸的色谱保留非常弱，富马酸和柠檬酸则保留非常强，色谱柱选择时需兼顾3者的分离效果。常用的阴离子交换体系主要有两种：碳酸盐和氢氧化物。以氢氧根为淋洗液的色谱柱其固定相官能团烷醇基季铵盐的亲水性比碳酸盐体系柱对应官能团烷基季铵盐强，对强保留组分阴离子具有更好的洗脱能力。因为氢氧化物体系具有强碱性，多价离子以高价离子形态存在，色谱峰形对称尖锐，灵敏度高。综上两点，选择使用氢氧根体系色谱柱。比较了7种最常见的AS11–HC，AS15，AS16，AS17，AS18，AS19，AS20色谱柱。实验发现，AS11–HC色谱柱对多种有机酸的同时分析具有优势，但是对于乳酸、乙酸和氟分离度较差，草酸和富马酸也很难实现基线分离，其余如AS16，AS17都有类似的分离情况。AS15，AS18和AS20上则对乳酸、乙酸分离较差。在AS19柱上乳酸与常见有机酸能实现基线分离，富马酸和柠檬酸也基本不存在干扰，因此选择AS19柱对淋洗条件进一步优化。最终确定氢氧化钾溶液梯度淋洗条件：0～15 min，2 mmol／L；15～30 min，2～40 mmol／L；30～40 min，40 mmol／L；40.1～43 min，2 mmol／L。在此条件下，样品中有机酸的分离度基本都能达到1.5以上，离子色谱图见图1。

图1 混合标准溶液离子色谱图

2.2 方法的检出限、定量限和线性方程

按照有机酸的色谱响应特性，配制系列乳酸、富马酸、柠檬酸混合标准溶液，按1.2节色谱条件进行测定，以各待测物的平均色谱峰面积y对其质量浓度x(mg／L)进行回归，其线性方程、相关系数和线性范围见表1。由表1可知，3种待测有机酸在各自的浓度范围内均具有良好的线性相关性，相关系数均不小于0.999。采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据色谱峰的信噪比(S／N)等于3确定检出限(LOD)，S／N等于10确定定量限(LOQ)，得到3种有机酸的LOD和LOQ见表2。考虑到样品前处理的稀释倍数，可换算得到样品(11.2 Brix)中测定低限(定量限)分别为0.5，0.3，0.2 mg／L。

表1 方法的检出限、定量限和线性范围

2.3 精密度试验

按照1.3方法对样品进行前处理，按1.2色谱条件直接在离子色谱系统上进样分析，外标法定量。对典型的浓缩苹果汁和脱色苹果汁样品溶液重复处理6次，分别进样测试，乳酸和柠檬酸的相对标准偏差在0.41%～0.63%之间，富马酸的相对标准偏差为1.43%，1.45%，结果见表2，表明方法具有良好的重现性。

表2 方法的精密度

2.4 回收试验

在典型苹果汁样品溶液(浓缩苹果清汁和脱色苹果汁)中添加乳酸、柠檬酸、富马酸的混合标准溶液，进行加标回收试验，结果见表3。

表3 方法的加标回收率

由表3可知，加标回收率为90.7%～102.8%，表明方法具有良好的准确度。浓缩苹果清汁样品色谱图见图2。

图2 浓缩苹果清汁样品谱图

按此方法测试了多种果汁样品中的乳酸、富马酸和柠檬酸含量，表4中列出了几种典型样品的测试结果。

表4 样品中乳酸、富马酸、柠檬酸的检出结果

3 结语

离子色谱法测定苹果汁中的乳酸、柠檬酸和富马酸，具有良好的分离能力。对于富马酸的定量限可以达到0.2 mg／L(11.2 Brix)，可满足AIJN［2］的检测要求5 mg／L(11.2 Brix)，灵敏度明显优于传统液相色谱法。该方法简便、可靠，精密度好，成本低，此方法也可适用于其它果汁、饮料、白酒、葡萄酒中有机酸的测定。

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