半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素体外重组表达及活性分析*

柳学周 刘芝亮, 徐永江 王妍妍 李春广

(1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071; 2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306; 3. 绍兴市鸿港农业开发有限公司 绍兴 312000)

生长激素(growth hormone, GH)是一种具有广泛生理功能的生长调节素, 分子量为21—22 kDa, 对鱼类的生长发育具有重要调控作用(Chenet al, 1994;Yoweet al, 1995; Benedetet al, 2005)。鱼类GH作为新陈代谢的调控子元件, 能够有效地促进脂肪更多分解为能源, 使吸收的氨基酸更多用于生长(Yoweet al, 1995), 同时可提高鱼类的食欲和饵料中蛋白质的转化效率(Silversteinet al, 2000), 促进肝糖原的消耗(Leunget al, 1991)和蛋白质的合成(Markertet al,1977; Johnssonet al, 1994)。GH在鱼体内多通路多层次上的综合调节, 有效地促进了鱼体的生长发育(Bjornsson, 1997)。研究表明, 体外重组GH与鱼体内天然GH具有相同的生物活性, 给鱼类注射或投喂天然或重组GH可使受体鱼食欲增强, 饵料的转化效率提高, 鱼体生长加快, 养殖周期缩短, 实现商品鱼尽快上市, 从而大大提高养殖效益(Mcleanet al, 1990;简清等, 1999; 马进等, 2001; 李晶等, 2004; 孙颖等,2006)。外源GH的生长促进作用可能通过鱼类后肠上皮细胞的泡饮作用吸收完整的外源GH蛋白, 从而使得具有免疫学活性和生物学活性的生长激素可以进入鱼类血液中, 从而促进鱼体生长(简清等, 1999;孙颖等, 2006)。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevisGünther), 属鲽形目(Pleuronectiformes)、舌鳎科(Cynoglossidae)、舌鳎属(Cynoglossus), 为东北亚特有的名贵冷温性底栖大型鲽形目鱼类, 是一种理想的近海增养殖对象(邓景耀等, 1988), 目前已成为我国三大鲆鲽类主导养殖品种之一。半滑舌鳎具有生长的性别二态性, 即雌性的生长速度远大于雄性, 因而养殖雌性苗种更具有经济性。但目前对半滑舌鳎生长调控机制的认识不足,不利于建立其养殖生长调控技术。鉴于GH在鱼类生长调控中的重要作用及其在雌雄个体生长过程中的差异表达特性(Maet al, 2011), 本研究构建了半滑舌鳎GH原核表达载体系统, 获得了具有免疫和生物活性的重组半滑舌鳎GH蛋白, 为从蛋白水平深入认识半滑舌鳎生长调控机制以及开发实用的半滑舌鳎生长调控技术提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

试验用半滑舌鳎5尾(全长39—48cm, 体重750—1120g)取自青岛忠海水产有限公司(青岛), 实验鱼运回实验室后, 以MS222 (280mg/L)麻醉处死, 迅速取其垂体和肝脏组织保存于液氮中(–196°C)用于总RNA提取。

1.2 GH成熟肽的克隆

利用RNAiso plus (TaKaRa)从垂体组织中提取总RNA, 检验浓度和纯度, 在M-MLV反转录酶(TaKaRa)的作用下合成第一链cDNA, 保存于–20°C备用。根据已知半滑舌鳎GH全长序列(GenBank Accession No.: FJ608663)设计特异性引物, 引物序列见表1。

表1 半滑舌鳎GH成熟肽扩增用特异性引物Tab.1 Primers for matured peptide of GH gene from C.semilaevis

在引物P1和P2的5’端分别加入了HindIII和XhoI酶切位点(方框标注), 同时将下游引物P2终止密码子TAG更换为强终止密码子TTA(阴影部分)。为保证重组蛋白翻译的氨基酸序列的正确性, 在上游引物P1中还额外添加了两个碱基(下划线标注)。利用引物P1和P2, 以垂体cDNA为模板PCR扩增得到GH成熟肽, PCR条件: 94°C 5min变性, 然后(94°C 30s, 61°C 30s, 72°C 50s) 34个循环, 最后72°C延伸10min, 将成熟肽片段连接到pEASY-T1载体上, 挑选阳性克隆送往北京华大基因测序验证。

1.3 原核表达载体的构建

选择测序正确的菌液进行PCR扩增, PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后将所得条带进行切胶回收纯化,分别对回收产物和pET-28a质粒进行双酶切, 得到具有相同黏性末端的GH和pET-28a基因片段。

将双酶切后的GH连接到线性化的pET-28a上,得到重组质粒GH/pET28a, 转化大肠杆菌DH5α(Invitrogen), 菌液PCR验证并测序。提取测序正确的重组质粒, 并制备含GH/pET28a质粒的表达菌株BL21(DE3)。

1.4 重组GH/pET28a质粒在大肠杆菌中的诱导表达

将含GH/pET28a质粒的表达菌株BL21(DE3), 在含卡那霉素的LB培养基中37°C震荡培养至OD600为0.6—0.7, 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 继续培养4 h, 诱导结束后, 8000 r/min离心10 min收集菌体, PBS洗涤并重悬菌体, 取20μL重悬后菌体加5μL 5×SDS-PAGE上样Buffer, 沸水浴5 min, 离心去杂质,SDS-PAGE电泳检测是否有GH融合蛋白表达。

将重悬后菌体在37°C扩大培养, 至OD600为0.6—0.7时, 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 相同条件下继续培养, 分别在诱导0h、1h、2h、3h、4h、6h后各取2mL菌液, SDS-PAGE电泳检测, SigmaScan pro 5软件分析不同诱导时间下融合蛋白表达率。另取部分重组菌分别在18°C、28°C和37°C条件下诱导培养4 h, 分析温度对融合蛋白表达的影响。

1.5 GH融合蛋白Western-blotting验证

收集诱导4 h的菌体沉淀和对照菌沉淀, 经SDSPAGE电泳后, 利用半干电转印法将蛋白转移至PVDF膜上, 用5% BSA封闭, 室温下一抗和二抗分别抚育2 h, 所用一抗和二抗分别为6×His Monoclonal Antibody(Clontech)和HRP标记的山羊抗小鼠IgG, HRP-DAB显色(Tiangen Biotech Co., Ltd), 数码相机拍照。

1.6 GH融合蛋白纯化和复性

将37°C条件下IPTG (1 mmol/L)诱导表达4 h的重组菌, 8000 r/min 4°C离心10 min, PBS洗涤沉淀,超声波破碎液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA)重悬菌体, 重悬后的菌液于冰浴中进行超声破碎, SDS-PAGE检测沉淀和上清。破碎后的沉淀用包涵体洗涤液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mol/L NaCl, 2 mol/L Urea, 1% Triton X-100)洗涤2—3次, 洗涤后的包涵体溶于包涵体裂解液(6 mol/L guanidine HCl pH 6.5, 0.4 mol/L NaH2PO4, 0.4 mol/L Na2HPO4, 0.5 mol/L NaCl) 4°C过夜变性, 变性后的包涵体12000 r/min离心10 min, 弃沉淀, 上清先后用0.8μm和0.45μm微孔滤膜过滤, 然后Ni2+-NTA亲和层析柱(TaKaRa)分离纯化融合蛋白。

分离后的融合蛋白SDS-PAGE电泳检测后装入到透析袋中, 分别用8 mol/L→6 mol/L→4 mol/L→2 mol/L尿素梯度复性液和PBS充分透析复性, 用10 kDa超滤管(Millipore)进行超滤浓缩, SDS-PAGE电泳检测, –80°C超低温冰箱保存。

1.7 GH融合蛋白的免疫活性测定

将纯化并复性后的GH融合蛋白复溶, Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo Scientific Co., Ltd)测定重组蛋白浓度。根据BCA蛋白定量分析试剂盒的测定结果将GH融合蛋白用ddH2O稀释106倍, 使稀释后的估测浓度在Fish GH ELISA Kit (CUSABIO公司, 上海)检测范围之内, 采用竞争酶联免疫法检测GH含量, 按照Fish GH ELISA Kit说明书测定GH融合蛋白浓度。

1.8 GH融合蛋白的生物活性检测

采用MTT法检测重组GH蛋白在细胞水平的生物活性。将纯化复性的重组蛋白过滤除菌待用。将生长状态良好的人乳腺癌细胞MDA231以1×105/mL密度接种于96孔板(每孔200μL), 培养24 h后, 弃去培养基加入含不同浓度重组蛋白(0.49, 2, 4.9和49μg/mL)的新鲜培养基, 并设空白对照组, 每组设4个平行,继续培养48 h后, 弃上清, 每孔加入90μL新鲜培养液, 再加入10μL MTT (Sigma)溶液, 继续培养4 h,弃上清, 每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)摇床低速震荡10 min, 使晶体物充分溶解, 酶标检测仪570 nm波长处读取各样品的光密度值。细胞增殖率(GSR)计算方法为: GSR (%control) = Asample / Acontrol×100, Asample为加入重组蛋白组, Acontrol为未加重组蛋白组。

1.9 数据处理

本研究所有数据采用平均值±标准差(Means±S.D.)表示, 以SPSS 17.0软件进行单因素方差(ANOVA)分析, 设置差异显著性水平P=0.05, 当P<0.05时视为差异显著。

2 结果

2.1 半滑舌鳎GH成熟肽的克隆

RT-PCR扩增脑垂体cDNA后, PCR产物经纯化、测序, 得到与NCBI上相一致的长552bp的半滑舌鳎GH成熟肽序列, 其编码183个氨基酸, 含四个半胱氨酸(Cys), 可形成两个二硫键, 且在成熟肽两端酶切位点加入正确, 可用于重组载体构建。

2.2 GH/PET28a重组质粒的构建

将正确克隆的GH成熟肽序列插入到原核表达质粒PET-28a上, 得到重组质粒GH/PET28a (图1),GH/PET28a重组质粒编码重组蛋白的序列(csGH)长681bp, 在T7启动子的作用下, 由起始密码子ATG开始编码重组蛋白, 到终止密码子TAA停止, 所编码的GH融合蛋白26 kDa, 等电点为7.77, 由227个氨基酸组成, 其中包括GH成熟肽和N端的6×His标签, 可进行诱导和蛋白纯化。

图1 GH/pET28a质粒的构建Fig.1 Construction of the recombinant expression plasmid GH/pET28a

2.3 重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

将重组质粒GH/PET28a转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达, 以未加诱导剂的重组菌为阴性对照。SDS-PAGE电泳显示, 在20.1 kDa和29 kDa之间出现特异性条带, 分子大小为26 kDa, 与预期结果一致(图2), 说明GH融合蛋白成功表达。

图2 半滑舌鳎重组GH/pET28a表达产物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis on GH/PET28a fusion protein of C.semilaevis

不同温度诱导条件下获得的GH融合蛋白表达量不同。由图3可知, 与18°C和28°C相比, 37°C温度下蛋白表达量较高, 结果显示诱导4 h时GH融合蛋白表达量达到最大(图2和图4), 占菌体总蛋白的41.5%, 此后蛋白表达量并不随时间的延长而增加,可知GH重组菌在37°C条件下以IPTG (1 mmol/L)诱导4 h GH融合蛋白可达到最佳诱导效果。

2.4 IGF-Ⅱ融合蛋白的western-blotting验证

图3 不同温度下重组GH/pET28a表达产物SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis on GH/PET28a fusion protein at different temperatures

图4 不同诱导时间下GH融合蛋白的表达量Fig.4 Expression percentage of GH fusion protein in different induction time

采用western-blotting免疫印迹方法对诱导4 h的重组菌进行检测, DAB显色后, PVDF膜上在标记位置可见单一清晰印迹(图5), 说明重组菌表达了融合蛋白, 且能特异性的被6×His抗体识别, 验证了半滑舌鳎GH融合蛋白表达成功。

图5 GH融合蛋白的western-blotting验证Fig.5 Western-blotting analysis on recombinant IGF-I protein

2.5 GH融合蛋白的ELISA测定

通过Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒测得纯化后的GH融合蛋白浓度为490μg/mL, 将融合蛋白稀释106倍后, 采用竞争酶联免疫法(ELISA)检测GH融合蛋白浓度, 结果显示重组GH融合蛋白可与鱼类生物素标记GH发生抗体竞争性反应, 测得稀释后重组GH融合蛋白浓度为502 pg/mL, 与BCA蛋白定量分析试剂盒测定结果基本一致, 可推断重组半滑舌鳎GH融合蛋白与其它鱼类GH具有相似的免疫活性。

2.6 GH融合蛋白的生物活性检测

以MTT法来检测不同浓度的重组GH融合蛋白对MDA231乳腺癌细胞增殖的影响, 结果如图6所示。各浓度组重组GH均未见明显的细胞增殖效果,自2μg/mL开始, 重组GH对细胞生长具有一定的抑制作用, 而以49μg/mL浓度组最为明显(P<0.01)。

图6 重组GH融合蛋白生物活性分析Fig.6 Bioactivity of recombinant GH protein of C. semilaevis

3 讨论

本研究选择了大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌,大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、工艺简单、产量高和生产成本低等特点, 而且也是目前研究最成熟的表达体系, 大肠杆菌虽缺少蛋白翻译后的修饰加工机制, 但鱼类GH翻译后无需糖基化修饰, 而且只含有两个二硫键, 容易复性, 因此大肠杆菌是表达鱼类GH的理想载体。研究选用pET-28a为表达载体,以T7 RNA聚合酶启动转录, 能转移识别T7强启动子, 具有比大肠杆菌RNA聚合酶高出数倍的转录效率。表达的蛋白为融合蛋白, N-末端含有His-Tag标签, 便于后期的分离纯化。

本研究构建的半滑舌鳎GH/pET28a重组质粒在原核表达载体BL21(DE3)中成功表达出分子量约26kDa的GH融合蛋白, 融合蛋白表达量较高, 占细菌总蛋白的41.5%。马骞等(2012)使用pET-32a载体成功表达出了GH融合蛋白, 其在表达系统构建过程中未将GH基因信号肽部分切除, 所以表达的GH融合多肽含有半滑舌鳎GH基因的完整ORF序列, 融合蛋白分子量约40kDa, 表达量占细菌总蛋白的37.6%,但未开展融合蛋白纯化和活性检测工作。信号肽的存在对基因的原核表达存在一定的影响(龚婷等, 2009),真核生物的信号肽在原核生物(如大肠杆菌)中表达时大部分不具有分泌功能, 而且始终与活性蛋白融合在一起, 影响活性蛋白的正确折叠与功能发挥, 因此本研究在构建半滑舌鳎GH/pET28a重组质粒时, 将GH基因ORF中的信号肽部分切除, 提高了表达水平,将表达产物进行了纯化和复性, 并对纯化复性后的GH融合蛋白的活性进行了初步研究, 为进一步研究GH蛋白的作用和作用机理奠定了基础。

纯化和复性后的半滑舌鳎GH融合蛋白的ELISA测定结果显示其与鱼类GH具有相同的抗原活性, 表明体外重组表达的半滑舌鳎GH融合蛋白具有免疫活性。利用细胞增殖试验验证其生物学活性时, 发现重组半滑舌鳎GH蛋白对人乳腺癌细胞MDA231无增殖效果, 而在高浓度才有显著的细胞生长抑制效果,因此无法断定其是否具有细胞水平的生物学活性,也同时说明获得的GH融合蛋白的生长调控作用不是通过直接作用于细胞实现, 可能是通过旁分泌的途径进行。养殖生产实践中, 有关GH的促生长作用,白俊杰等(1999)直接将基因重组的鲤鱼GH 添加到饲料中投喂罗非鱼, 证实有明显的促生长作用, Jeh等(1998)将通过大肠杆菌重组表达的牙鲆GH蛋白作为饲料添加剂投喂牙鲆幼苗, 促生长效果明显。因此,今后本实验室将继续开展重组半滑舌鳎GH融合蛋白对半滑舌鳎幼鱼生长调控作用的相关实验, 以验证体外重组GH融合蛋白对半滑舌鳎的促生长效果。

原核表达系统中目的蛋白的表达量受多种因素影响, 如重组菌浓度、诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度等, 本研究中对对GH融合蛋白的最适诱导温度和诱导时间进行了探讨, 结果显示低温时可产生少量可溶性蛋白, 但融合蛋白含量较低, 纯化效果较差,37°C时蛋白表达量最大, 主要以包涵体形式存在, 虽然需要增加复性步骤, 但纯化过程较容易, 得到的融合蛋白较多, 为后续实验提供了条件。随着诱导时间的增加, 蛋白表达量逐渐增加, 到达4 h时达到最大,再增加诱导时间蛋白表达量并不随之增加, 推测其原因可能有两个方面: 一方面BL21(DE3)虽然为蛋白酶缺陷菌株, 诱导时间过长, 随着细菌的代谢产物增加, 插入的外源蛋白仍不可避免会遭受宿主的降解, 从而不利于表达蛋白的收获; 另一方面可能胞体内不断积累的外源蛋白包涵体对宿主菌产生毒素效应, 从而限制了蛋白的积累。

实验条件下原核表达系统有很多优势, 如工艺简单、产量高、生产成本低等, 但将其应用与生产实践时就体现出很大的局限性, 如需进行蛋白纯化和生物活性恢复, 后续工作比较繁琐, 在大规模生产方面酵母表达系统更有优势, 因此半滑舌鳎GH真核表达系统的构建将成为后续实验的重点。本实验结果为半滑舌鳎GH重组蛋白在水产养殖中的应用奠定理论基础。

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