凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Runt转录因子的基因克隆及其功能分析*

王晓雯 梁 艳 邢 婧 刘旭雅 黄 倢①

(1. 中国海洋大学水产学院 青岛 266003; 2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛 266071)

Runt转录因子家族(RUNX)是一种在细胞增殖、分化和维持干细胞方面起着重要作用的细胞转录因子(Braunet al, 2009; Cohen, 2009), 普遍存在于哺乳动物、无脊椎动物, 具有进化保守性。据文献报道, 第一个Runt基因是从果蝇中被发现的, 它编码一个Runt蛋白的一个结构域(Gergenet al, 1988)。对不同物种的Runx基因研究显示, 其编码的蛋白产物都由α、β亚单位构成异二聚体。α亚单位含有一个128个氨基酸组成的RD (Runt domain)保守域, 可介导RD与DNA结合及蛋白之间的相互作用(Bartfeldet al,2002; Miyazonoet al, 2004)。目前在哺乳动物体内发现了3种Runx基因(runx1, runx2, runx3), 其中Runx1在造血系统中起着重要作用, Runx2与骨生成作用有关, Runx3则控制胃上皮细胞的增殖(Specket al,1999)。现在对哺乳动物(尤其是人类)Runt基因功能的研究已经很详细, 更多的研究转向无脊椎动物方面, 以了解Runt在分化过程中更为原始的蛋白功能。在果蝇的研究中发现晶体细胞(crystal cells)区别于浆血细胞(plasmatocytes), 不参与细胞吞噬, 而是通过发生黑化来参与免疫反应。晶体细胞可以表达果蝇分化必需的细胞因子Lz蛋白(一种Runt家族蛋白), 而在缺乏Lz表达的生物体内则缺乏晶体细胞(Rizkiet al, 1959; Canonet al, 2000; Lebetskyet al, 2000)。

无脊椎动物没有特异性免疫系统, 当体外受到刺激或者造成对自身健康机体威胁时, 血细胞会急剧减少。迅速地恢复血细胞, 发挥吞噬作用、黑化作用等清除异物的功能, 对机体来说很关键(Söderhället al, 1998; Johanssonet al, 2000)。因此造血作用和释放血细胞到循环系统在无脊椎动物体内发挥着最重要的免疫功能。Runt结构域蛋白被证实参与了哺乳动物和果蝇的造血作用和促进血细胞分化作用。在软尾太平蝲蛄(Pacifastacus leniusculus) Runt蛋白的研究中发现注射外源葡聚糖(β-1,3-glucan), 可在短时间内显著提高造血细胞中Runt的转录量, 而proPO却几乎检测不到。另外, Runt转录发生在颗粒细胞和半颗粒细胞中, 可能是造血细胞成熟为颗粒细胞的指示基因(Söderhället al, 2003), 在调节和维持血细胞数量上有着重要作用。目前尚未有关于对虾类Runt家族蛋白的相关研究报道。

在本研究中, 作者克隆得到了凡纳滨对虾Runt基因的cDNA全长, 分析了其在不同组织中的转录分布, 以及人工注射造血激素(Astakine, AST)和感染病毒后对其转录水平的影响, 以期为进一步了解Runt转录因子在无脊椎甲壳类动物中的功能提供分析数据。

1 材料与方法

1.1 凡纳滨对虾

凡纳滨对虾于2012年7月20日购自青岛宝荣水产公司, 体长约8cm, 25尾/组, 暂养于50L水体中,盐度25, 温度26°C, 每天换水1/2, 投喂一次饲料,暂养一周。按国标方法经PCR检测无WSSV感染(GB/T 28630.2-2012)。

1.2 白斑综合征病毒(WSSV)毒种液

取100g本实验室－80°C保存的感染WSSV的凡纳滨对虾去除肝胰腺的头胸甲, 剪碎, 加入预冷的TESP缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl, pH 8.5, 使用时加入1×蛋白酶抑制剂PMSF), 10000r/min高速匀浆5s, 8000r/min 4°C下离心5min, 取上清过筛绢, 用0.45μm滤膜过滤除菌,分装并保存于－80°C冰箱待用。

1.3 凡纳滨对虾血细胞RNA的提取

取凡纳滨对虾血淋巴400μL与柠檬酸钠抗凝剂(27mmol/L柠檬酸钠, 336mmol/L NaCl, 115mmol/L葡萄糖, 9mmol/L EDTA.2Na)按1︰1比例混合, 1200r/min离心10min, 收集细胞沉淀, 加入800μL TRIzol (Takara),按照其附的操作方法采用氯仿抽提法提取总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 凡纳滨对虾Runt(lvrunt)全长cDNA的克隆

1.4.1 同源克隆lvruntcDNA片段 根据NCBI数据库中9个已知物种Runt基因序列(软尾太平蝲蛄,AJ506096; 果蝇, AF217651和X56432; 紫色球海胆,U41512; 萨氏九杯蛛, AJ272529; 爪蟾, AF035446;原鸡, Z36530; 小家鼠, D26532; 人, L34598), 设计1对简并引物runt-F和runt-R (表1)。以凡纳滨对虾血淋巴细胞cDNA为模板进行同源克隆, 获取Runt cDNA的部分片段。25μL反应体系中含10μL 10×Buffer, 8μL 2.5mmol/L dNTP, 各1μL的10mmol/L runt-F和runt-R, 0.2μL 5U/μL Ex Taq酶(Takara), 1 μL cDNA模板, 于94°C预变性5min, 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 35个循环, 72°C延伸10min。将扩增产物经过胶回收后进行TA克隆(Frolanmanet al, 1988),并将阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。

根据同源克隆获得的cDNA片段序列设计特异性引物GSPI、NP3、GSPII和NP5, 分别用于RACE实验, 引物序列见表1。

表1 实验中用到的引物序列Tab.1 Primers used in the experiment

1.4.2lvrunt基因的5′-RACE 5′-RACE扩增使用了商品试剂盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech, 美国), 以提取的总RNA(浓度为200μg/μL)为模板, 按其使用手册方法合成5′- RACEReady cDNA。以基因特异性引物GSPII (5′)和NP5分别与UPM(通用接头引物, 试剂盒提供)为引物,5'-RACE-Ready cDNA为模板进行套式PCR扩增。20μL体系中含10μL 10×Buffer, 8μL 2.5mmol/L dNTP,各1μL的10mmol/L GSPII(5′)(NP5)和UPM, 0.2μL 5U/μL Ex Taq酶(TaKaRa), 1μL cDNA模板。扩增产物经TA克隆后送华大基因公司测序, 获取lvruntcDNA的5′末端序列。

1.4.3lvrunt基因的3′-RACElvrunt基因的3′- RACE扩增使用了商品试剂盒Trans Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix Kit(TransGen, 北京), 以提取的总RNA(浓度为200μg/μL)为模板, 用接头引物3′CDs-primerA取代试剂盒中的Oligo(dT)18, 合成3′-RACE-cDNA。20μL体系中含500ng RNA模板,10pmol 3′CDs-primerA, 10μL 2×TS Reaction Mix,1μL Enzyme Mix, 42°C保温30 min后, 于85°C终止反应5min, 冰上冷却。以基因特异性引物GSPI(3′)和UPM(试剂盒提供)为引物, 3′-RACE-cDNA为模板,进行第一轮PCR; 再以此扩增产物为模板, 用基因特异性引物NP3和接头引物UPM, 进行套式PCR, 2次PCR反应程序为: 94°C预变性5min; 94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 40s循环数为10; 94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 40s, 循环数为25; 72°C延伸10min。扩增产物经TA克隆后并测序, 以获得lvruntcDNA3′端序列。

1.5 lvrunt全长cDNA序列及其编码的多肽序列分析

用NCBI数据库和在线SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de)分析全长lvruntcDNA序列及其编码的多肽序列, 利用Clustaxl软件对该基因编码氨基酸和其它种类的runt-family编码的氨基酸序列进行比对, 利用MEGA5.1软件建立进化树。

1.6 lvrunt基因的组织表达分析

随机选取凡纳滨对虾3尾, 分别采集其鳃、肠、肝胰腺、类淋巴、心脏、肌肉组织和血淋巴, 按1.4方法用氯仿抽提法提取总RNA。以提取的总RNA (浓度为300μg/μL)为模板, 采用Trans Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix试剂盒(TransGen, 北京),以Oligo(dT)为反转录引物, 按试剂盒操作手册合成cDNA。根据已得到的lvrunt基因序列设计引物(Lvrunt-F, Lvrunt-R), 并以凡纳滨对虾18S rRNA (引物设计为18S-F, 18S-R)作为内参, 使用Bio-Rad荧光定量PCR仪, 对各组织lvrunt表达量进行分析, 荧光定量PCR反应条件为: 95°C预变性5min, 95°C 15s,61°C 30s, 40个循环。设定肠中该基因的表达量为“1”,结果采用2–ΔΔCt法计算, 用SPSS软件进行数据分析。

1.7 注射重组表达的凡纳滨对虾造血激素(rLvAST)对lvrunt基因转录水平的影响

选用凡纳滨对虾225尾(25尾/箱)分为三个实验组, 每组3个平行, 各25尾, 分别于第二腹节肌肉注射50μL的PBS、BSA(50μg)和BSA与rLvAST(各25μg)混合物, 每组3个平行。分别于注射后0、3、6、12、24、36、48和72h采集2尾对虾的血淋巴, 按1.6方法测定lvrunt表达量。

软件定义天地一体化网络：架构、技术及挑战…………………………许方敏，仝宗健，赵成林，秦智超 24-2-59

1.8 白斑综合征病毒感染后凡纳滨对虾Runt基因的表达分析

选取凡纳滨对虾30尾, 在对虾第二腹节肌肉内注射20μL稀释了1000倍的WSSV毒种液, 感染凡纳滨对虾, 于感染后0、1、7、12h和3、5和10d抽取对虾血淋巴, 按1.6方法检测lvrunt表达量。

2 结果

2.1 凡纳滨对虾Runt基因(lvrunt)全长的扩增

通过在线软件CODEHOP设计了不同种类Runt基因的保守区上下游简并引物, 对从凡纳滨对虾血淋巴细胞mRNA反转录所得的cDNA进行扩增, 得到174bp产物(图1a), 经测序和初步分析, 序列所编码的氨基酸序列与Runt基因保守区编码的氨基酸序列相似, 确定所获产物为lvrunt片段的部分序列。

根据已知的lvrunt部分序列进行5′-RACE, 设计外侧引物GSPII (5′), 与接头引物进行第一次扩增,得到了一条大约500bp的条带(图1b)。将第一次扩增所得产物稀释10倍作为模板, 用内侧引物NP5进行套式PCR, 获得约500bp的特异条带(图1c), 经测序获得核苷酸序列466bp。

根据已知的lvrunt部分序列进行3′-RACE, 设计外侧引物GSPI (3′), 与接头引物UPM一起对凡纳滨对虾血淋巴来源的cDNA进行第一次扩增, 获得弥散分布的产物(图1d), 再以第一次扩增产物的1/50稀释度为模板, 用内侧引物NP3进行套式PCR, 获得约1000bp的特异条带(图1e), 经测序, 得到1040bp核苷酸序列。

根据5′-RACE和3′-RACE所得序列, 拼接得到lvrunt的全长序列。

2.2 lvrunt全长序列特征

拼接所得的凡纳滨对虾runt的cDNA全长序列共1754bp(图2), 经分析, 该全长序列中含有1个663bp开放阅读框(ORF), 编码221aa, 理论分子量为23.6kDa, 5′-UTR (非编码区)为466bp, 3′-UTR(非编码区)为625bp, 其中包含1个PolyA尾, 并出现一加尾信号。

2.3 凡纳滨对虾转录因子(LvRunt)蛋白结构特征分析

凡纳滨对虾转录因子(LvRunt)通过估算, 分子量为23.6kDa, 预测的等电点为7.57。通过SMART、NCBI、OMIGA的分析表明LvRunt蛋白序列的第4—148个氨基酸范围内是一个runt-family结构域(图3),53—139aa为IG_FLMN域(细丝蛋白型的免疫球蛋白域), 62—89aa为KOW模体, 104—111aa为ATP/GTP结合模体, 46—50aa为DNA结合区域, 210—219aa是低复杂性区域(LCR)。

图1 凡纳滨对虾Runt基因全长的分段扩增结果Fig.1 Amplification of the fragments of L. vannamei Runt gene full-length

图2 凡纳滨对虾Runt基因cDNA全长序列及编码氨基酸序列Fig.2 The full-length nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of L. vannamei runt gene cDNA

2.4 不同种类Runt保守性分析

从GenBank上获得了分别属于扁形动物门、节肢动物动物、半索动物和脊椎动物的16个不同物种的Runt蛋白氨基酸序列, 通过Mega 5.05软件进行保守性分析(图4)。结果表明凡纳滨对虾Runt氨基酸序列与软尾太平蛄(Pacifastacus leniusculus)(CAD 44570.1)的相似度为88.1%, 与丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)(XP_001603414.2)有74.3%的相似度, 与埃及伊蚊(Aedes aegypt)(XP_001657548.1)有61%的相似度, 与其他种类的氨基酸序列相似性在30%—52.4%范围内, 该蛋白表现较高的种间保守性。另外,这些Runt蛋白均有一个runt-family结构域runt domain(RD)。凡纳滨对虾Runt蛋白的RD与软尾太平蝲蛄的相似度高达97.7%, 与其他物种蛋白的相似度在72.3%—97.7%(图5)。

图3 凡纳滨对虾runt氨基酸序列的SMART蛋白功能分析及二级结构预测Fig.3 The SMART analysis for the protein function and the secondary structure prediction on the ammonia acid sequence of the L.vannamei runt

图4 利用NJ法绘制的不同动物的Runt同源蛋白进化树Fig.4 Neighbor-joining phylogenic tree of amino acid sequences of runt genes and its homologous gene runx from different species

2.5 lvrunt基因在凡纳滨对虾体内的不同组织表达差异

以18S rRNA为目的基因, 通过实时荧光定量PCR对lvrunt在凡纳滨对虾不同组织的表达分析, 检测到这7种组织均有lvruntmRNA的表达。该实验经过溶解曲线验证了扩增的特异性, 不存在非特异性扩增及引物二聚体的干扰。根据2-ΔΔCt方法对结果进行分析, 以肠组织作为校正样品(Calibrator), 表达量设为1, 比较不同组织中lvrunt在凡纳滨对虾组织中的表达(图6)。结果显示lvruntRNA在血淋巴中表达量最大, 显著高于其他组织, 是其他组织中表达量的20—346倍。由于对虾是开放的循环系统, 各组织中均有血淋巴细胞的存在, 推测其他组织中lvrunt的表达很可能都是由于组织中血淋巴细胞的表达所致,换而言之,lvrunt基因的表达可能作为组织中血淋巴细胞量的一种指示。

2.6 注射对虾造血激素(Astakine)后lvrunt基因转录水平变化

对凡纳滨对虾注射PBS、BSA和BSA+rLvAST的三个组的lvrunt转录量均在注射6h达到峰值(图7),BSA+AST组的lvrunt表达量急升到原来的接近600倍, 12h内下降并基本维持稳定, 但72h内仍然高于初始基本水平。其中BSA和BSA+AST注射组Runt基因表达量明显高于PBS注射组, 而BSA+AST注射组lvrunt基因表达量约为BSA注射组的3.35倍, 差异显著(P<0.05)。

图5 不同种类的Runt结构域氨基酸序列比对Fig.5 Sequence alignment of the Runt domain in different species

图6 实时荧光RT-PCR对lvrunt在凡纳滨对虾不同组织中的相对表达量分析Fig.6 Quantitative analysis of the lvrunt mRNA in different tissues of L. vannamei by real-time RT-PCR

2.7 注射WSSV后lvrunt基因的表达变化

凡纳滨对虾经注射WSSV毒种液后, 其血淋巴中的lvrunt表达经荧光定量PCR分析(图8), 显示在注射后12h, 凡纳滨对虾血细胞的lvrunt转录量达到最大值, 达到正常值的25倍左右。但随着时间延长, 在感染后第3天显著下降, 但仍比初始水平高约5倍左右, 随着感染进程的延伸,lvrunt的表达量又逐渐升高, 在10d时达到初始水平的10倍左右。

图7 注射造血激素后凡纳滨对虾血淋巴中Runt转录水平情况Fig.7 Expression levels of lvrunt in hemocytes after injection of rLvAST

图8 感染WSSV后凡纳滨对虾血淋巴Runt基因转录量分析Fig.8 Temporal expression patterns of lvrunt in hemocytes after challenged with WSSV

3 讨论

Runt基因是普遍存在于多种生物的一种转录因子, 含有一个DNA结合域(Runt Domain), 这个结合域从昆虫到哺乳动物都高度保守(Kagoshimaet al,1993; Wolffet al, 1999; Kataokaet al, 2000)。本研究克隆得到的凡纳滨对虾的Runt蛋白序列中就包含了这个runt family功能区域, 并与软尾太平喇姑有高达97.7%的相似度, 与其他种类也是相对保守的, 这可能与Runt在不同生物的生命活动中发挥的作用相似有关。据报道, 最早发现的果蝇体内的Runt结构域基因runt和lozenge可以在生长过程中发挥多种作用,并且lozenge可以促进晶体血细胞的分化(Canonet al,2000)。对哺乳动物的研究发现了三类Runt基因, 证明是造血作用和骨生成必不可少的因子(Westendorfet al, 1999; Linggiet al, 2002; Ottoet al, 2002)。还有研究还表明, Runt基因的缺失会影响细胞周期蛋白B(cyclin B)与细胞周期蛋白依赖性激酶cdc 2(cell division cycle)复合物的活性, cyclin B-cdc 2复合物不仅决定细胞是否进入M期, 也决定细胞是否能退出M期。如果细胞不进入M期它将不进行分裂, 如果在M期退不出来会使细胞过度增殖, 产生肿瘤等有害影响(翟中和等, 2002; 曾亚, 2004)。本文克隆结果表明, 凡纳滨对虾仅存在一种Runt基因(lvrunt), 这与两栖动物和海胆中只存在一种基因类型的报道是一致的(葛辉等, 2007)。lvrunt序列与软尾太平蝲蛄相比, 在Runt结构域相似度很高, 但是RD下游的序列差异较大, 并且没有Runt基因常见的VWRPY序列作为C末端, 这一motif不会或者很少会影响转录活性(Okudaet al, 2000), 可能会在促进DNA结合的功能上产生一些差异(Kagoshimaet al, 1993)。

对凡纳滨对虾Runt基因的不同组织表达分析显示,lvrunt几乎只在血淋巴有表达, 在其他组织的表达量远远低于血淋巴, 可以认为是分析其他组织时候有部分血细胞存在的影响, 因此Runt的表达量也可能作为组织中血细胞数量的一个分子指标。表达组织分布结果也揭示了lvrunt在血液系统中发挥着主要作用, 这与Runt在果蝇内促进血细胞分化, Runx1在高等哺乳动物体内具有造血功能的研究结果相吻合(Specket al, 1999)。

已有研究表明, 造血激素在螯虾体内有促进造血和血细胞分化的作用, 而Runt也有促进转录和血细胞分化作用。实验中注射了造血激素后, 对虾血淋巴中lvrunt转录水平显著增加, 可见造血激素促进了Runt基因转录。尤其是在注射后6hlvrunt转录水平达到最高值, 这样可能会通过细胞信号传导, 进一步促进细胞进入分裂状态。对凡纳滨对虾注射WSSV后12h,lvrunt转录水平达到峰值。有研究显示, 斑节对虾感染WSSV后12h总血淋巴数(THC)达到一个最低值, 但这时WSSV在体内的感染应该还处于潜伏期, 病毒含量没有达到很高水平(张涛等, 2012), 而在3—10d的时期是WSSV感染的高峰期,lvrunt的表达却比12h时低得多, 这提示lvrunt的表达不是因为WSSV感染所致, 12h时lvrunt的高表达可能是由于血淋巴细胞对异物刺激发生反应, 数目急剧下降, 通过活化lvrunt的转录, 来促进细胞的分裂和分化, 以使机体有能力参与免疫反应。

本文通过RACE方法克隆得到了凡纳滨对虾的Runt基因的序列, 是首个关于对虾属的相关研究。本文还通过该基因的组织表达分布特征分析, 揭示其主要在血淋巴细胞表达, 这可能与其作用有关。并且采用荧光定量 PCR的方法分析了凡纳滨对虾在注射rLvAST和经过WSSV感染后的转录变化, 初步了解lvrunt的表达状况, 为更深入了解对虾的造血机制以及参与对虾免疫作用奠定了基础。

张 涛, 郭志勋, 黄建华等, 2012. 低剂量对虾白斑综合征病毒粗提液对斑节对虾体内潜伏期病毒及血细胞的影响.水产学报, 36(10): 1544—1552

葛 辉, 王秀利, 仇雪梅等, 2007. 海胆Runt基因保守序列的克隆与初步分析. 生物技术通报, 4: 125—127

曾 亚, 2004. 国外医学——生理、病理科学与临床分册, 22(2):103—105

翟中和, 王喜忠, 丁明孝, 2000. 细胞生物学. 北京: 高等教育出版社, 358—372

Bartfeld D, Shimon L, Graeme C Coutureet al, 2002. DNA recognition by the RUNX1 transcription factor is mediated by an allosteric transition in the RUNT domain and by DNA bending. Structure, 10: 1395—1407

Braun T, Woollard A, 2009. RUNX factors in development:lessons from invertebrate model systems. Blood Cells,Molecules, and Diseases, 43: 43—48

Canon J, Banerjee U, 2000. Runt and Lozenge function inDrosophiladevelopment. Semin Cell Dev Biol, 11(5): 327—336

Cohen M M Jr, 2009. Perspectives on RUNX genes: an update.American Journal of Medical Genetics Part A, 149A: 2629—2646

Gergen J P, Butler B A, 1988. Isolation of theDrosophilasegmentation gene runt and analysis of its expression during embryogenesis. Genes & Development, 2: 1179—1193

Johansson M W, Keyser P, Sritunyaluksana Ket al, 2000.Crustacean hemocytes and haematopoiesis. Aquaculture, 191:45—52

Kagoshima H, Shigesada K, Satake Met al, 1993. The runt domain identifies a new family of heterometric transcriptional regulators. Trends in Genetics, 9(10): 338—341

Kataoka H, Ochi M, Enomoto Ket al, 2000. Cloning and embryonic expression patterns of the zebrafish Runt domain genes, runxa and runxb. Mechanisms of Development, 98:139—143

Lebetsky T, Chang T, Hartenstein Vet al, 2000. Specification ofDrosophilahematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science, 288: 146—149

Linggi B, Muller-Tidow C, Van de Locht Let al, 2002. The fusion protein, AML1 ETO, specifically represses the transcription of the p14(ARF) tumor suppressor in acute myeloid leukemia. Nature Medicine, 8: 743—750

Miyazono K, Maeda S, 2004. Imamura T coordinate regulation of cell growth and differentiation by TGF-β superfamily and Runx proteins. Oncogene, 23: 4232—4237

Okuda T, Takeda K, Fujita Yet al, 2000. Biological characteristics of the leukemia-associated transcriptional factor AML1 disclosed by hematopoietic rescue of AML1-deficient embryonic stem cells by using knock-in strategy. Molecular and Cellular Biochemistry, 20: 319—328

Otto F, Kanegane H, Mundlos S, 2002. Mutations in the RUNX2 gene in patients with cleidocranial dysplasia. Human Mutation, 19: 209—216

Rizki M T M, Rizki R, 1959. Functional significance of the crystal cells in the larva ofDrosophila melanogaster.Cytology, 5: 235—240

Söderhäll I, Bangyeekhun E, Mayo Set al, 2003. Hemocyte production and maturation in an invertebrate animalproliferation and gene expression in heatopoietic stem cells ofPacifastacus leniusculus. Developmental and Comparative Immunology, 27: 661—672

Söderhäll K, Cerenius L, 1998. Role of phenoloxidase activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology, 10: 23—28

Speck N A, Stacy T, Wang Qet al, 1999. Core-binding factor: a central player in hematopoiesis and leukemia. Cancer Research, 59: 1789—1793

Westendorf J J, Hiebert S W, 1999. Mammalian runt-domain proteins and their roles in hematopoiesis, osteogenesis, and leukemia. Journal of Cellular Biochemistry-Supplement,32/33: 51—58

Wolff C, Pepling M, Gergen Pet al, 1999. Structure and evolution of a pair-rule interaction element: runt regulatory sequences inD. melanogasterandD. virilis. Mechanisms of Development, 80(1): 87—99