栉孔扇贝BI-1基因的克隆与表达分析*

苗国英 亓海刚 李 莉 阙华勇① 张国范 胡晓丽

(1. 中国科学院海洋研究所 青岛 266071; 2. 中国科学院大学 北京 100049; 3. 中国海洋大学 青岛 266003)

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国重要的养殖贝类, 自然分布于我国北方黄渤沿海以及朝鲜和日本沿海(王如才等, 1993)。贝类的大规模人工繁育以及养殖生产实践表明, 优良种质是决定贝类产业能否健康可持续发展的首要因素, 选育抗逆性强、生长性状优良的品系, 是贝类育种的重要目标(张国范,2006)。开展栉孔扇贝功能基因研究, 有助于从分子水平上研究重要生命现象的基本规律, 推动栉孔扇贝基础研究并为良种选育提供参考。

凋亡(apoptosis)是细胞在特定应激条件下或者特定发育阶段下发生的可调控的死亡现象, 又称细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)。凋亡本质上是一种具有自我保护和调节性质的细胞死亡事件,涉及一系列相关基因的激活、表达及调控等作用, 是由基因控制的基本生物学过程之一(张晓晖等, 2002)。

Bax Inhibitor-1 (BI-1)基因是一种细胞凋亡调控因子, 存在于所有脊椎动物中, 该基因主要定位于大鼠的7号染色体、小鼠的15号染色体、猪的5号染色体和人的12q12-q13 (Walteret al, 1994, 1995; Kimet al, 2003)。该基因首先是在1994年由Walter等人在小鼠的睾丸基因库中发现的, 并命名为TEGT(testis enhanced gene transcript) (Walteret al, 1995),其后Xu等(1998)在酵母中克隆出了能抑制Bax作用的基因, 命名为Bax Inhibitor-1, 即BI-1。BI-1蛋白是一个大小为25—27kDa的跨膜蛋白, 一般含有6—7个跨膜结构域(Bolducet al, 2003; Kawai-Yamadaet al, 2004), 主要定位在细胞的内质网膜、核外膜, 包含多个苏氨酸磷酸化位点, 但缺乏O-糖基化位点及N-糖基化位点(Xuet al, 1998; Kawai-Yamadaet al,2001; Bolducet al, 2003)。BI-l基因主要通过参与线粒体和内质网途径发挥对细胞凋亡的调节功能(Kawaiet al, 1999; Tsujimotoet al, 2003; Chaeet al,2004)。

BI-1基因作为一种重要的凋亡调控因子, 在一些物种中已有了深入的研究(Hückelhovenet al, 2001;Bolducet al, 2002; Coupoet al, 2004; Watanabeet al,2009), 但是在贝类中的分子类型和作用还没有被揭示。因此, 本研究通过RACE技术克隆了栉孔扇贝(Chlamys farreri)中的BI-1基因全长cDNA序列, 并进一步采用荧光定量PCR技术揭示了该基因在栉孔扇贝不同组织中的表达情况和在不同应激条件下的表达变化特点。本研究旨在为开展栉孔扇贝BI-1基因的功能以及栉孔扇贝凋亡相关基础研究提供参考数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验所用栉孔扇贝(壳长50mm±5mm)均来自青岛胶南山东头村扇贝养殖场, 扇贝取回后清除表面污物和附着生物, 于18°C海水中充气暂养, 每日更换过滤海水, 并投喂三角褐指藻、金藻和螺旋藻粉混合饵料, 一周后用于实验。

1.2 总RNA提取和cDNA的合成

取健康的栉孔扇贝, 抽取其血液, 按照Trizol法提取总RNA。总RNA的完整度用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。取1μg总RNA, 参照立陶宛Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit使用说明, 反转录合成cDNA模板, 置于-20°C的冰箱保存备用。

1.3 CfBI-1基因cDNA片段的克隆

在GenBank上找到人、非洲爪蟾、果蝇等物种的BI-1蛋白序列, 并将这些序列用tBLASTn程序与栉孔扇贝转录组测序序列进行比对, 得到了与这些物种BI-1相近的基因片段, 根据期望值、相似度、得分等参数将基因片段筛选, 从而获得CfBI-1基因的候选序列片段。根据获得的基因片段设计扩增引物F1和R1 (表1)。以栉孔扇贝的cDNA为模板, F1和R1为引物, 进行CfBI-1基因片段的扩增与测序验证。PCR反应体系为25μL, 反应条件如下: 94°C预变性3min; 94°C变性30s、56°C退火30s和72°C延伸1min,35个循环; 72°C延伸10min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小后, 产物使用DNA胶回收试剂盒(上海生物工程技术服务公司)回收目的片段产物。回收的目的片段连接到PMD19-T载体(TaKaRa), 重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术公司), 涂板, 37°C过夜培养, 挑取抗氨苄青霉素的阳性克隆, 菌落PCR验证目的片段符合预期大小后, 送上海生物工程技术服务公司测序。

1.4 CfBI-1基因全长cDNA的获得

采用巢式PCR和RACE方法扩增基因的3′和5′末端。上述测序结果经过BLASTx比对后验证为CfBI-1基因片段, 根据其分别设计3′RACE和5′RACE的引物3′F1、3′F2、5′R1、5′R2 (表1)。3′末端首轮PCR反应体系为Premix LA Taq 12.5μL, 引物3′F1 1μL, Oligo(dT)-adapterprimer(dTAP) 2.5μL, 模板cDNA 1μL, 灭菌双蒸水8μL; 反应程序为: 94°C预变性5min; 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 1min 30s, 35个循环; 72°C延伸10min。第二轮PCR引物为3′F2和AP(表1), PCR模板为首轮扩增产物, 退火温度为56°C,其他条件同首轮。5′末端扩增时, 首先使用末端转移酶在cDNA3′末端加上poly C尾, 以加尾的cDNA为PCR模板; 首轮PCR反应体系为Premix LA Taq 12.5μL, 引物5′R1和Oligo(dG)-adapterprimer(dGAP)(表1)各1μL, 模板1μL, 灭菌双蒸水9.5μL; 反应程序: 94°C预变性5min; 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 1min 30s, 35个循环; 72°C延伸10min。次轮PCR引物为5′R2和AP, PCR模板为首轮扩增产物, 退火温度为58°C, 其他条件同首轮。PCR扩增产物的电泳检测、回收纯化、克隆测序等操作同上述cDNA片段克隆。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 CfBI-1基因的序列分析和系统进化分析

用Bioedit软件对上述所获测序序列进行全长拼接; ORF Finder程序(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)预测开放阅读框, 并获得编码的氨基酸序列; 用SMART程序(http: //smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白结构域的预测; 从GenBank下载小鼠、人、斑马鱼、紫贻贝等物种的BI-1基因的蛋白序列, 用ClustalX程序进行蛋白多序列比对后, 用MEGA5.0程序中的邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建基因系统发生树。

1.6 干露刺激

将60只暂养一周的栉孔扇贝放于干燥的玻璃板上, 室温温度控制在20°C, 分别在0、2、4、6、8、12、24h随机取6只扇贝, 取血淋巴, 500g, 4°C, 离心10min, 弃上清, 留血淋巴用于RNA制备。

1.7 脂多糖(LPS)刺激

将100只暂养一周的栉孔扇贝随机分为两组, 每组约50只, 为实验组和对照组, 分别养殖在两个水池中。实验组的扇贝每只注射100μL LPS (0.5mg/mL),对照组的扇贝每只注射100μL灭菌的磷酸盐缓冲液(PBS)。分别在注射0、3、6、12、24、48、72h从各组随机取6只扇贝, 取血淋巴, 500g, 4°C, 离心10min,弃上清, 留血淋巴用于RNA制备。

1.8 急性病毒性坏死症病毒(Acute Viral Necrobiotic Disease Virus, AVNV)刺激

将急性病毒性坏死症病毒所感染的组织(由黄海水产研究所王崇明老师提供)称重, 每克组织加9mL的PBS缓冲液, 冰浴研磨匀浆, 4°C, 4000×g离心5min, 将上清液移到新的离心管中, 将沉淀再进行一次研磨, 8000×g离心5min, 将两次的上清液合并到一个管中, 13000×g离心10min, 澄清的组织匀浆在无菌的条件下, 用2、0.8、0.22μm的滤膜过滤, 将所得到的滤液-20°C保存备用。

将120只栉孔扇贝随机分为两组, 每组约60只,为实验组和对照组。实验组的扇贝每只注射100μL的病毒液, 对照组的扇贝每只注射100μL的灭菌的PBS。分别于注射后0、3、6、12、24、48、72h从各组随机取6只扇贝, 取血淋巴, 500×g, 4°C, 离心10min, 弃上清, 留血淋巴用于RNA制备。

1.9 CfBI-1基因的表达分析

参照Trizol(Invitrogen)说明书提取栉孔扇贝各组织(血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、消化腺)及干露、LPS、病毒刺激实验样品的总RNA, 用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)试剂盒合成一链cDNA用于荧光定量表达分析。根据栉孔扇贝BI-1基因和内参基因β-actin (GenBank序列号为AAP88387), 分别设计一对荧光定量的引物CfBI-1F′和CfBI-1R′, β-actinF′和β-actinR′ (表1)。荧光定量PCR的反应体系为20μL: 2×SYBR® Premix Ex TaqTM10uL cDNA模板2μL, 荧光定量引物各0.4μL, 50×ROX Reference Dye II 0.4μL, DEPC水6.8μL。每个样品设置3个重复。反应程序为95°C预变性2min; 95°C 15s, 60°C 25s, 68°C 20s, 40个循环。采用2-ΔΔCT法计算CfBI-1基因的表达量, 并采用SPSS 18.0软件和SAS 9.1软件分别进行one-way ANOVA分析和Duncan检验, 以P<0.05作为显著性差异。

2 结果

2.1 CfBI-1基因的全长cDNA序列分析

根据设计的特异性引物克隆得到CfBI-1基因的部分片段, 然后根据该片段设计RACE引物进行3′和5′端的扩增, 得到3′和5′末端的序列, 最后拼接得到一条完整的cDNA序列。其全长为957bp (Genbank注册号为KF913642), 其开放阅读框(ORF)长度为711bp, 5′非编码区(5′-UTR)为48bp, 3′-UTR为195bp,3′-UTR区含有多腺苷酸化加尾信号aataa (图1)。CfBI-1基因预测编码一个含有237个氨基酸的蛋白质, 分子量为27kDa, 结构域预测发现CfBI-1蛋白含有六个跨膜结构域。

2.2 CfBI-1基因的系统进化分析

将CfBI-1蛋白序列与其他物种的同源蛋白在ClustalX中进行多序列比对分析发现, 栉孔扇贝BI-1基因与小鼠(Mus musculus)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)、人(Homo sapiens)、斑马鱼(Danio rerio)及果蝇(Drosophila melanogaster)的BI-1氨基酸同源性分别为48.95%、63.56%、49.37%、49.79%和36.29% (图2)。使用MEGA软件构建BI-1氨基酸系统进化树显示, 栉孔扇贝BI-1基因与紫贻贝聚为一支, 之后又与猪蛔虫(Ascaris suum)和斑马鱼等聚类(图3)。该基因的系统进化关系与传统的物种进化地位基本一致。

2.3 CfBI-1基因的表达分析

2.3.1 CfBI-1基因在各组织的表达分析 通过Real-time PCR技术检测CfBI-1基因在栉孔扇贝不同组织中的表达情况, 结果显示, CfBI-1在所检测的鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、消化腺和血淋巴六个组织中均有表达, 且在闭壳肌中表达量最高, 而在血淋巴中表达量最低(图4)。

图1 CfBI-1基因cDNA全长及预测的氨基酸序列Fig.1 CfBI-1 full-length cDNA and deduced amino acid sequence

2.3.2 CfBI-1基因在干露刺激下的表达分析Real-time PCR检测了栉孔扇贝在干露刺激后不同时间点血淋巴中的BI-1基因的表达变化(图5)。结果表明: 在干露刺激初期(0—2h), BI-1基因的表达水平没有明显变化; 在干露刺激后4h, BI-1基因的表达水平迅速升高, 达到0h的约3.09倍(P<0.05); 在干露刺激后6h, BI-1基因的表达水平达到最高, 约为0h的25.50倍(P<0.05), 在刺激后期(8—24h), BI-1基因的表达水平略有下降, 但与0h仍有显著性差异(P<0.05)。

2.3.3 CfBI-1基因在LPS刺激下的表达分析Real-time PCR检测了栉孔扇贝在LPS刺激后不同时间点血淋巴中的BI-1基因的表达变化(图6)。结果表明, 在LPS刺激的过程中, 实验组与对照组的表达均没有明显升高, 并且两组之间没有明显差异。

2.3.4 CfBI-1基因在急性病毒性坏死症病毒刺激下的表达分析 Real-time PCR检测了栉孔扇贝在急性病毒性坏死症病毒刺激后不同时间点血淋巴中的BI-1基因的表达变化(图7)。结果表明: 在病毒刺激以后, 实验组的BI-1基因的表达水平呈现先升高后下降的趋势, 在刺激后24h, 实验组的表达量为对照组的1.82倍(P<0.05), 在病毒刺激后48h实验组达到最高值, 约为对照组的1.75倍(P<0.05)。

图2 不同物种BI-1氨基酸序列多重比对分析Fig.2 Multiple alignment of the amino acid sequence of BI-1 among different species

图3 CfBI-1基因的NJ系统进化树Fig.3 NJ phylogenetic tree of the CfBI-1 gene sequences

3 讨论

图4 CfBI-1基因在栉孔扇贝不同组织中的表达Fig.4 Expression levels of CfBI-1 in different tissues of Chlamys farreri

图5 CfBI-1基因在干露刺激后的表达水平Fig.5 Expression levels of CfBI-1 under air exposure stimulation

图6 CfBI-1基因在LPS刺激后的表达水平Fig.6 Expression levels of CfBI-1 under lipopolysaccharide(LPS) stimulation

图7 CfBI-1基因在急性病毒性坏死症病毒刺激后的表达水平Fig.7 Expression levels of CfBI-1 under acute viral necrobiotic disease virus (AVNV) stimulation

目前, 在水生生物中BI-1基因的研究还比较少,尤其是在贝类中的特点和功能仍有待研究和揭示。本研究首次通过RACE技术获得了栉孔扇贝BI-1基因的cDNA序列, 并获得可能的编码蛋白序列。同源分析和分子进化聚类分析结果显示, CfBI-1蛋白序列与其他一些物种BI-1序列具有很高的相似性, 表明该基因在进化上和功能上的高度保守性。BI-1蛋白在哺乳动物和植物中主要定位在细胞的内质网膜、核外膜,蛋白包含多个苏氨酸磷酸化位点, 但缺乏O-糖基化位点及N-糖基化位点(Xuet al, 1998; Kawai-Yamadaet al, 2001; Bolducet al, 2003), 结构域预测CfBI-1蛋白含有六个跨膜结构域, 表明CfBI-1蛋白在栉孔扇贝中的细胞定位可能与哺乳动物相同。

BI-1基因不仅在人体心脏、胎盘、脑、肝、肺、骨胳肌等组织中广泛表达(Adamset al, 1995; Xuet al,1998), 且在多种恶性肿瘤细胞中高度表达, 这与其对凋亡的抑制作用紧密相关(Villalvaet al, 2002;Grzmilet al, 2003)。本研究发现CfBI-1基因在栉孔扇贝的鳃、外套膜、闭壳肌、性腺、消化腺和血淋巴六个组织中均有表达, 表明CfBI-1对栉孔扇贝的正常生命活动起到一定作用, 且表达无明显的组织特异性; 在闭壳肌中表达量显著高于其他组织, 表明在闭壳肌中较高浓度的BI-1蛋白抑制细胞凋亡水平对维持闭壳肌正常生理功能可能有重要作用。

为进一步探究CfBI-1基因在栉孔扇贝中的功能,本研究分别检测了干露、LPS和急性病毒性坏死症病毒刺激栉孔扇贝后CfBI-1基因的表达变化。在干露和病毒刺激以后, 在不同时间点, 表达水平发生了明显的升高, 而在LPS刺激以后没有明显变化, 说明不同的刺激源引起的细胞应激类型、细胞凋亡程度和凋亡信号通路可能有所不同。干露作为一种物理刺激,主要导致扇贝处于脱水低氧的胁迫状态, 在干露刺激后4—6h CfBI-1表达即显著上调, 上调幅度较大,能够维持至刺激后24h, 说明CfBI-1基因参与了细胞干露应激的响应过程, 干露可能会在较短时间内导致细胞内稳变化并启动凋亡程序。病毒刺激后24、48h CfBI-1表达显著高于对照, 表明CfBI-1基因参与了病毒介导的免疫反应。Taura综合症病毒感染后的南美白虾中包含BI-1结构域的基因表达量也显著上调(Zenget al, 2013), 与我们的研究结果类似。但是病毒刺激后CfBI-1上调幅度较小, 72h后表达量开始回落, 推测病毒感染后免疫反应导致的细胞凋亡程度可能低于干露刺激。而在LPS刺激后, 在0—72h内均未观察到CfBI-1表达变化, 表明CfBI-1对LPS刺激无明显响应过程。综上, 我们认为CfBI-1基因参与了干露刺激和急性病毒性坏死症病毒感染应激过程,在这些刺激所导致的细胞凋亡过程中可能发挥重要凋亡调节功能。

致谢 感谢中国水产科学研究院黄海水产研究所王崇明老师提供扇贝急性病毒性坏死症病毒病料组织。

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