HCCR及其在消化系统肿瘤中的诊疗价值

舒婷婷，卢启明，王巧丽，冯 婧

（1.兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000）

近十年，食管癌、胃癌和结肠癌等消化系统肿瘤在我国的发病率呈上升趋势。消化系统恶性肿瘤已成为危害人类健康最严重的肿瘤性疾病，其早期诊断对于及时确定治疗方案和延长患者生存期均有重要意义。目前认为，肿瘤的发生、发展是多种基因突变逐渐积累参与的复杂过程，由于环境及自身因素引起的多基因的突变，导致正常细胞的增殖、凋亡以及染色体的稳定性改变，使肿瘤新生物具有了血管形成、侵袭及向远处转移的能力[1-2]。因此，了解在肿瘤恶化早期起作用的基因的生物学功能，将会为肿瘤的预防、诊断提供线索，同时提高癌症患者的生存率。目前临床上常见的肿瘤标记物筛查消化系统恶性肿瘤的效果很不理想，容易漏检及出现假阳性，急需发现灵敏度和特异性均较高的新肿瘤标记物。人宫颈癌基因（HCCR）是由韩国科学家Ko等[3]发现的一种与多种肿瘤发生相关的原癌基因，对其功能研究表明，HCCR在早期肿瘤中的表达更明显，提示HCCR与人类多种恶性肿瘤的早期发生有关，有可能成为恶性肿瘤基因治疗的新靶点，为治疗消化系统肿瘤带来新的曙光。本文就HCCR在消化系统肿瘤中的研究进展做一简要综述。

1 HCCR 及其蛋白结构

HCCR基因是Ko等[3]用差异显示RT-PCR法，从原发子宫颈癌组织、转移淋巴结灶及子宫颈癌细胞系CUMC-6中筛选、鉴定出一段异常表达有206bp的不完全cDNA片段，该片段称为CC214，其定位于人染色体12q。由于前体mRNA选择性拼接加工不同，可引起两种选择性剪切：HCCR-1和HCCR-2。HCCR-1由9个外显子构成，共编码360个氨基酸，其编码的蛋白分子量为42kDa，HCCR-2编码序列除缺少HCCR-1外显子（exon1）的部分序列外，其余编码核苷酸序列与HCCR-1相同，HCCR-2可编码304个氨基酸，其蛋白分子量为36kDa。这两个亚型的3'非转录区是完全一致的。HCCR-2蛋白是HCCR-1蛋白的拼接变异体，在HCCR-1的258核苷酸区发生A与G的替换，造成HCCR-1的异亮氨酸转换为HCCR-2的缬氨酸。NIH/3T3细胞软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验均提示HCCR-2的致癌性比HCCR-1更强。

2 人类肿瘤发生的细胞生化机制

Ko等[4]在2004年构建了含有HCCR-2的转基因小鼠模型，其形成的肿瘤表现出上皮癌的特征，在体内模拟了HCCR-2强制表达可单独诱发乳腺癌及转移灶。但是HCCR同人类肿瘤发生的细胞和生化机制还不是十分清楚。Cho等[5]对荧光素酶进行活性分析表明，HCCR-1的5'侧翼区-166到30的基因片段在HCCR-1转录活性中起着重要作用。经过对这个区域的计算分析确定了两个位于-26到-4（Tcf1）和-136到-114（Tcf2）的T-细胞因子受体。迁移率变动分析（EMSA）显示，核蛋白质只特异结合Tcf1区域，而非Tcf2区域，突变在Tcf1区域导致转录活性显著降低。使用荧光素酶和Wnt信号激活阻断剂GSK-3β（糖原合成酶激酶-3）后，含有Tcf1的野生型构建体报告活动显著增强，但含有Tcf1突变的构建体细胞则不被影响。此外，内源性HCCR-1的表达也增强。同时还观察到，转录因子、Tcf、共刺激因子β-连环蛋白都结合Tcf1区域位点。HCCR-1的Tcf1区域是一个调节HCCR-1的表达和本区域异常刺激的主要区域，可诱发各种癌症。2007年Cho等[6]又利用生物信息学工具预测了HCCR-1蛋白的生物特性，并确定了HCCR-1蛋白从75位到346位的氨基酸序列为LETM1同源结构域，该结构域包含不同种的线粒体蛋白。荧光显微镜和分馏实验表明，HCCR-1定位在绿猴肾细胞系COS-7、人乳腺癌细胞系MCF-7和人胚肾HEK/293细胞系的线粒体内膜。拓扑结构分析发现，HCCR-1的NH2末端朝向细胞质，该D1-2区即HCCR-1蛋白第1～110位氨基酸序列，是转录后的线粒体入口，具有线粒体生物学功能。

3 HCCR-2 与P53

P53具有“分子警察”的功能，P53蛋白的缺失、突变和失活，在恶性肿瘤的激化演变过程中起着重要的作用[7]。P53蛋白的主要功能包括诱导细胞周期阻滞、修复DNA损伤和促进细胞凋亡，从而避免受损DNA的堆积、维持基因组的持续稳定以及调节细胞的分化与衰老、抑制肿瘤血管增生等。P53的下游基因主要包括P21、CD95/fas、P53AIP1、pag608、gadd45、MDM2、Bax、Cyclin等[8]。Ko等将转染HCCR的NIH/3T3细胞注入裸鼠体内，发现有肿瘤形成，而P53蛋白总表达却未见下降，进一步检测P53蛋白下游的P21、MDM2、Bax基因的表达，发现其水平均有所降低，表明P53蛋白总量虽然保持稳定，却不能保持正常功能[4]。杨燕等[9]构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR，将其转染肝癌HepG2细胞。Westernblot（蛋白质印迹法）结果显示，HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后，细胞内P53蛋白的表达降低，P15蛋白的表达明显升高，而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变。这也进一步表明HCCR与P53蛋白的关系不简单，一般认为它可能与P53的负性调节有关，通过使P53表达下降或者失活，从而导致肿瘤的发生。

4 HCCR 的调节机制

Cho等[10]观察HCCR-1的5'侧翼区，并确定包括假定性同源结构域蛋白结合位点的HCCR-1启动子。NIH/3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）中HCCR-1启动子被磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）激活，此启动子在K562细胞中也能够被野生型Akt活化。使用PI3K特异性抑制剂LY294002作用后，HCCR-1的表达下降，并呈剂量依赖性。这些结果表明，HCCR-1的表达受PI3K/Akt调节。张盛等[11]在胰腺癌细胞SW1990中验证了这一通路。使用表皮生长因子（EGF）处理胰腺癌细胞SW1990，随着作用时间增加，HCCR表达水平增高。使用PI3K/Akt通路抑制剂后，HCCR表达水平明显下降。

Shin等[12-13]研究发现，HCCR-1通过与HCCR-1结合蛋白-1（HCCRBP-1）作用，直接稳定P53的作用，导致肿瘤发生。最近Ha等[14]又发现一种新的HCCR-1结合蛋白HCCRBP-3。HCCRBP-3在多种肿瘤中过度表达，NIH/3T3细胞稳定转染的裸鼠注射HCCRBP-3也能诱发肿瘤的形成。此外，P53在HCCRBP-3转染的细胞中表现功能障碍并伴随P21和Bax诱导缺陷。P53的反应性元件P21基因启动子活性被HCCRBP-3以剂量依赖性方式抑制。因此，研究表明HCCRBP-1、HCCRBP-3有助于HCCR-1通过中断P53功能诱导肿瘤形成。

Shin等发现从K562细胞核中提取的蛋白质有识别和绑定位于HCCR-1启动子的Tcf1区域的野生型特定序列的作用。他们构建了数个HCCR-1的近端启动子区域的删除突变体，用GSK-3β 阻断剂处理HEK/293和K562细胞后，内源性HCCR-1的合成增加。这些发现表明，HCCR-1启动子的Tcf1区域是一个主要调节HCCR-1表达的区域。异常刺激本区域可能诱发各种癌症。

HCCR通过线粒体激活介导途径介导细胞凋亡异常参与肿瘤的发生。体外研究显示，HCCR-1蛋白是线粒体膜上K/H离子交换泵的重要组分，K/H交换泵的缺陷会引起线粒体肿胀和凋亡，HCCR的过度表达可以引起线粒体生存时间明显延长，促进肿瘤的发生[6-15]。

5 临床应用前景

目前，恶性消化系统肿瘤临床进展快、患者生存期短，传统临床治疗的中远期疗效不理想，因而寻找新的肿瘤治疗方法是全球临床及科研工作者所面临的问题。通过cDNA阵列比较杂交法（comparativehybridizationofcDNAarrays）、RT-PCR和Northerm印迹杂交等方法分析肝癌及癌旁组织中的基因表达水平。结果显示，HCCR在肝癌组织中高表达，但在癌旁组织中不表达[16-17]。HCCR这种在肿瘤组织中高选择性表达的特点，使得靶向HCCR的基因治疗能够精确定位于癌变组织，有效破坏癌变细胞特有的生存机制，诱导细胞凋亡，降低肿瘤的生长潜能。因此，以HCCR为靶点的各种治疗技术有望成为临床肿瘤治疗新的切入点。目前的研究主要集中在RNA干扰（RNAi）技术、反义寡核苷酸技术、抗体制备技术这几方面。

RNA干扰是通过短双链RNA与mRNA中的同源序列结合形成RNA诱导沉默复合物，诱导靶基因降解，进而高效特异性阻断目的基因表达的转录后基因沉默的技术。姜琳等[18]研究食管癌EC9706细胞HCCR-2的siRNA转染细胞，下调HCCR-2蛋白及mRNA的表达，观察到细胞凋亡增加，细胞周期出现G0/G1期阻滞，P53下游基因P21与P27的表达增加。

反义寡核苷酸技术是根据碱基互补原理，用人工合成或设计目标DNA或mRNA的序列片段，从而抑制或封闭目标靶基因表达和功能发挥的基因封闭技术。刘安定等[19]构建了pcDNA3.1-HCCR反义真核表达质粒，利用反义RNA技术转染HepG2细胞，RT-PCR检测显示HCCRmRNA表达降低。转染后24小时HCCRmRNA水平下降到16%，其蛋白表达水平在24小时也明显降低。对细胞的增殖与凋亡活性检测显示：转染HCCR反义质粒后，HepG2细胞增殖受到抑制，转染后24小时抑制率为47.62%，细胞凋亡率为14.34%±0.91%，细胞分裂多停止在G0、G1期。这些结果表明，可以以HCCR为靶点进行基因导入，从而进一步增强癌症的治疗效果，遏制恶性肿瘤的发生和发展。

国内张晓勇等[20-22]致力于制备HCCR重组蛋白和单克隆抗体的研究。耿东进等[21]在细菌中制备了HCCR-1和HCCR-2蛋白质，其分泌抗体效价高且均能特异识别重组蛋白，为建立新的早期诊断方法和开发肿瘤疫苗奠定了可靠基础。

6 展望

随着对HCCR机制和功能的理解不断加深，我们逐渐意识到其对于人类恶性肿瘤预防与治疗的重要性。早期测定HCCR的水平，不但可以筛选出具有恶性转化可能的高危病变，便于及早进行预防和采取治疗措施，而且将HCCR应用于制备肿瘤疫苗，也会给肿瘤的治疗带来新的契机[23-24]。对于这种基因，其自身激活、致癌机制以及与其他分子的相互作用等还有许多问题尚未研究清楚，我们还需要更多前瞻性的临床研究来测试和验证。

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