m iRNA-216a与胰腺癌的研究进展

李少杰，侯宝华，区金锐

1．南方医科大学，广东广州510515;2．广东省人民医院(广东省医学科学院)普通外科

胰腺癌是一种恶性程度高、预后极差的肿瘤，发病率在世界范围内逐年上升。近20年以来，胰腺癌的发病率在美国增加了3倍，我国增加了6倍［1］。手术切除是目前唯一能使胰腺癌得到根治的方法，但由于胰腺癌患者早期缺乏特异的临床症状和体征，以及碍于目前检测手段的限制，大部分该病患者在就诊时已到晚期，并且其对放化疗都不敏感，从而失去了可能手术切除的机会，总体5年生存率低于3%［2］。据统计，2011年美国胰腺癌的新发病中约四分之三以上死于胰腺癌，发病人数和死亡人数几乎相等［3］。虽然胰腺癌的发病机制未完全明确，但人们已经证明其发生发展过程的重要分子学表现是一系列信号通路和重要基因的改变。因此，从胰腺癌分子生物学和病理生理角度进行深入研究，对预防胰腺癌、寻找特异的肿瘤标志物和新的靶向治疗点具有重要意义。近年来发现许多miRNA参与了胰腺癌的生物调控，间接地发挥着抑癌基因和致癌基因的作用。

1 m icroRNA简介

自从Lee等［4］在1993年利用遗传分析的方法发现了第一个miRNA(lin-4)之后，miRNA从此受到了广泛的关注。2002年，Calin等［5］对其开创性的研究成果报道，使miRNA成为肿瘤研究中的新焦点。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的具有调控功能的非编码RNA，它在物种进化中比较保守，其组织和细胞的功能特异性是由组织的特异性和时序性所决定。miRNA基因产生的初级产物primiRNA在核内被切割，形成具有发夹结构的miRNA前体(pre-miRNA)。pre-miRNA在细胞内的转运蛋白的作用下，从核内运输到胞质中，茎环结构被Dicer酶切割成双链的miRNA，然后解链产生成熟的miRNA分子［6］。miRNA的多样性与保守性决定了其在生理、生化功能上的重要性与普遍性。在生物生长发育过程中，miRNA在调控基因表达方面尤为重要:miRNA发挥功能主要依赖与其靶基因3'非翻译区完全或不完全互补配对而诱导靶向mRNA的降解或者抑制靶向mRNA的翻译，从而影响靶蛋白的表达水平，但不影响miRNA的稳定性;除此之外，多个miRNA可以共同调控同一基因，同时单个miRNA可以有很多个靶基因，这也说明miRNA可能影响所有的信号转导。目前研究已发现了上万种miRNAs，其中属于人类的已超过千条miRNAs。

许多恶性肿瘤发病机制尚未完全明确，但其发生发展过程均与一些基因的改变相关，基因改变主要体现在原癌基因的激活、抑癌基因突变而失活、生长因子及或其受体的表达上调，而miRNAs能够调控该基因的功能，从而起到影响肿瘤发生的作用。

2 m icroRNA与胰腺癌

循环中miRNA能够稳定存在于血液中而游离于细胞之外，其在循环或组织中的表达上调或下调与多种恶性肿瘤的发展进程密切相关，此外，miRNA作为一个微调分子，在转录后水平调控靶基因表达，在疾病发展阶段起到的作用越发显著。

2．1 循环中m iRNA与胰腺癌 Valadi等［7］首次证明可从血清中提取并确定游离miRNA的含量。Chen等［8］通过运用先进的测序技术发现，miRNA占血清中小分子RNA的绝大部分比重，而且这些小分子RNA具有耐酸碱、抗RNA酶及抗物理化学处理的稳定性。Zerecke等［9］研究了微泡中miR-126的功能，首次正面回答了循环中miRNA是否具有生物学活性的问题。循环中的miRNA主要由组织细胞主动分泌，在细胞内进一步被脂蛋白或脂质包被形成外切酶体(Exosome)，这一过程使成熟的miRNA初现，后经细胞分泌进入血液，外切酶体去掉包被，释放出miRNA发挥其生物学功能。在健康人的血清中，miRNA的表达基本无异常，但是当人体存在恶性肿瘤时，血清miRNA的表达会发生明显变化。

在胰腺癌患者循环中显著上调的基因有miR-16、20a、21、24、25、99a、155、185、191、210、196a、451等。Wang等［10］发现，胰腺癌患者血浆中miR-210、miR-21、miR-196a、miR-155表达上调。进一步分析这4种miRNA联合检测作为区分胰腺癌与正常人群标志物的诊断灵敏度可达64%，特异度可达89%，其中miR-155的表达水平在胰腺癌形成的早期就明显升高，而miR-196a的表达高低和患者病程发展密切相关。Wei等［11］发现，非胰腺癌患者血清miR-16、miR-196a的表达明显低于胰腺癌患者，而且将肿瘤标志物CA19-9与循环中miR-196a、miR-16联合检测，可以使胰腺癌诊断的特异性和敏感性分别提高到92．0%和95．6%。Kong等［12］研究发现手术无法切除的胰腺导管腺癌患者血浆miRNA-196a水平明显高于可以手术治疗的患者。Liu等［13］报道血浆中miR-451的表达水平在胰腺癌病例组和健康对照组中存在差异，在胰腺癌病例组的血浆中显著上调，并利用7种血清miRNA(miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-99a、miR-185、miR-191)共同作为诊断标志物的准确率高于现行常规检测所使用的CA19-9和CEA的准确率。而且这7种miRNA在I期胰腺癌患者血清中的表达量大于正常人血清中表达量。Li等［14］检测了正常人和胰腺恶性组循环中miRNA-200a、miRNA-200b的表达量，结果发现miRNA-200a和miRNA-200b的表达在二者的循环中存在显著性差异，与胰腺恶性组相比，差异有统计学意义(P＜0．05)。在未来研究中，将进一步探索循环中miRNA来预测胰腺癌发生、发展的过程，为阐述和验证胰腺癌具体的发生发展机制和胰腺癌分子靶向治疗寻找新的突破口。

2．2 组织中m icroRNA与胰腺癌 最近研究表明，在胰腺癌中超过100种miRNA异常表达，并且超过50%的miRNA编码基因位于肿瘤相关的脆性位点。miRNA在肿瘤中的表达具有组织特异性且异常表达，在不同肿瘤组织中miRNA具有不同的表达谱。由此可推断miRNA可能成为胰腺癌早期诊断的新分子标志物，并对胰腺癌的发生进展起到类似癌基因或抑癌基因的作用。

研究发现miR-196a、miR-21、miR-27a、miR-155、miR-10b等在胰腺癌中高表达，而这些高表达的miRNA可能与促进胰腺癌的发生、侵袭转移、预后相关，起到癌基因的作用。Szafranska等［15-16］研究指出，miRNA-196a等仅在胰腺癌中表达异常，进一步研究发现miRNA-196a在正常胰腺导管细胞、正常胰腺腺泡细胞和PanIN-1b病变中阴性表达，而在胰腺导管腺癌、PanIN-2和PanIN-3中miRNA呈阳性表达，提示miRNA-196a与胰腺癌的胰腺癌的侵袭转移有关。Dillhoff等［17］在一项80例胰腺癌患者研究中发现，miRNA-21强阳性表达仅出现在胰腺癌标本中，如果在非肿瘤组织中检测到miRNA-21，那么仅呈弱阳性表达。并且发现高表达miR-21的预后(中位生存期15．2个月)显著低于miR-21低表达患者(中位生存期27．7个月) (P=0．037)。Ma等［18］研究发现，miRNA-27a在胰腺癌组织中呈过表达，下调miRNA-27a表达后胰腺癌细胞生长速度、复制速度以及侵袭能力均下降，而且对细胞侵袭能力起抑制作用的 Sprouty2蛋白表达上调。Greither等［19］发现在胰腺癌中miR-155、miR-203、miR-210、miR-222等高表达的患者预后较差。Nakata等［20］发现胰腺癌组织miR-10b上调，miR-10b能促进胰腺癌细胞的发生发展和侵袭，miR-10b表达水平与胰腺癌患者预后显著负相关，即miR-10b高表达提示着预后不良。

在胰腺癌中表达下调或缺失的microRNA可能在胰腺癌的形成和发展中起到抑癌基因的作用。2007年Bloomston等［21］研究发现胰腺癌组织中miRNA-375表达降低，在胰腺癌进展中起到类似抑癌基因的作用。后期发现胰腺癌患者中6种miRNA(miR-452、miR-105等)表达水平升高者其生存时间较普通患者更长(超过2年)。在体内、体外实验中均发现miR-96水平的升高可使胰腺癌的侵袭和转移能力降低，同时伴随K-ras表达水平降低［22］。

3 m iR-216a在胰腺癌中的表达

miR-216a定位于基因组2p16．1。研究表明miR-216a在胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中表达下调。Kong等［23］在动物体内发现miR-216a可当作急性胰腺炎发作时胰腺损害的潜在标志物。Szafranska等［24］发现miRNA-216是胰腺组织所特异的，但miRNA-216在胰腺癌组织及癌细胞株中并不表达或仅微量表达。因此，miRNA-216a可能是有潜力的生物标记物。我们的前期研究比较胰腺癌和正常胰腺组织中microRNA表达，发现70个microRNA的表达存在统计学差异，其中与正常组织相比，hsa-miR-216a等在胰腺癌患者中表达显著下调。

4 m iR-216a在胰腺癌发生发展中可能起到的作用

miRNA通过与靶mRNA的3＇UTR碱基配对，从而抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，在转录后水平导致基因沉默。YB-1(Y box-binding-1)蛋白是一种核酸结合蛋白，它通过结合许多基因的启动子上的Y-box序列来促进基因的转录，在乳腺癌的研究中科学家们发现YB-1为miR-216a的一个靶基因，miR-216a能下调转录因子 YB-1的表达［25-26］。Jeyapalan等［27］通过检测发现miR-216a可使其靶蛋白CD44的表达降低，从而抑制血管内皮细胞活化达到限制肿瘤血管新生的目的。张雪梅等［28］研究发现miR-216a可抑制胃癌细胞生长增殖和侵袭能力，并证实了PKCα(蛋白激酶Cα)是miR-216a调控的直接靶基因，通过siRNA干扰实验证实了下调PKCα表达确实能抑制胃癌细胞增殖和侵袭能力。赵文健等［29］等研究证实了PKCα是miR-216a调控的直接靶基因，并且也通过siRNA干扰实验证实了下调PKCα表达确实能抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭，它能部分模拟miR-216a的抑瘤功能，说明miR-216a可通过靶向调控PKCα表达抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭，这进一步揭示了miR-216a的抑瘤分子机制。我们前期通过研究发现miR-216a在胰腺癌组织中的表达明显低于胰腺良性病变组织，提示miR-216a表达下调参与了胰腺癌的发生，miR-216a在胰腺癌发生中可能起抑癌基因的作用，进一步研究筛选并验证JAK2是miR-216a的靶基因，在体内外细胞、动物实验水平验证了miR-216a能通过抑制靶基因JAK2表达水平，而抑制肿瘤生长。说明miR-216a可通过靶向调控 JAK2表达抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭。

5 m iR-216a在胰腺癌中的表达意义

miR-216a可能成为胰腺癌的肿瘤标志物。Sun等［30］发现miR-216是胰腺高特异性miRNA之一。动物实验研究显示miR-216a在胰腺炎大鼠血清也特异性高表达［31］。miR-216a在胰腺癌中的表达下调，让我们可以认为通过对患者血液、粪便、尿液、胰液、胰腺穿刺组织等检测miR-216a含量，来提高胰腺癌的早期诊断率和明确鉴别诊断，但是miR-216a在胰腺癌患者组织等的表达检测仍受检测技术等方面的限制，使miR-216a成为胰腺癌的肿瘤标志物并且广泛用于临床诊疗方面需进一步研究和发展。

miR-216a有望作为胰腺癌靶向治疗点。Chen等［32］报道建立K-ras(val12)突变基因的siRNA腺病毒表达载体，转染胰腺癌细胞诱导凋亡、逆转肿瘤恶性表型;有研究证实［33］利用RNAi抑制凋亡相关基因Survivn表达，可诱导胰腺癌细胞株凋亡，并能提高其辐射敏感性。我们利用模拟激动剂(hibitor和agomir-216a)通过细胞水平实验、动物实验证明抑制靶基因JAK2表达，进而促进胰腺癌细胞的凋亡，抑制胰腺癌裸鼠模型瘤体的生长。所以可以对miR-216a进行基因沉默、反义寡核苷酸阻断或miRNA修饰，可能为胰腺癌提供新的治疗途径。虽然目前临床应用并不十分满意，但动物试验结果令人振奋，可以肯定的是，miRNA 216a在胰腺癌诊断标志物和治疗手段具有重要的潜在价值。

6 展望

随着miRNA研究的兴起和深入研究，以及在检测特异性miRNA各种不同研究方法和新技术、新科技的应用，为人类肿瘤治疗提供了新的方向和崭新手段。miRNA与胰腺癌的发生、发展、预后、治疗密切相关，但其在胰腺癌中的作用机制还未完全明确，在临床应用方面还未深入进行，miR-216a作为胰腺癌的一个起到抑癌作用的潜在基因，检测其在胰腺癌中低表达，并证实其通过抑制相关靶基因促进胰腺癌细胞的凋亡，提示其在精确调控蛋白质编码基因上可能有重要作用。MicroRNA检测对胰腺癌的早期诊断和细胞靶向治疗都有很大的临床价值，相信随着生物医学技术的不断进步，在胰腺癌的早期有效诊治方面MicroRNA将发挥极其重要的用途。总之，miRNA将成为胰腺癌诊断、疾病预防、生物治疗的创新点、突破口、新方案，有着无限的应用前景和不可低估的社会和经济价值。

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