m icroRNAs在肝纤维化形成中的作用

王 军，李光明

上海交通大学医学院附属新华医院消化内科，上海200092

肝纤维化是由多种病因所致肝内弥漫性细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积的病理生理过程［1］。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)激活是肝纤维化发生发展的中心环节，各种损肝因素引发肝细胞凋亡坏死、炎性细胞浸润，促使炎性细胞因子、氧化应激产物释放，可通过不同机制激活HSC。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类由20～24个核苷酸组成的内源性非编码RNA，通过与靶mRNA完全或不完全配对形成沉默复合体，miRNAs可诱发靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻译，从而在转录后水平对基因转录进行负调控［2］。已证实人类超过三分之一的基因受miRNAs调控［3］。自1993年miRNA家族成员lin-4和let-7首次被发现以来，迄今已在193个物种发现了 25141种 miRNAs(ftp://mirbase．org/pub/mirbase/CURRENT/README)［4］。日益增加的证据显示:miRNAs不仅可调控肝脏对损伤因素的修复反应，而且可作为评估肝损伤程度的一类新型分子标志物。深入研究miRNAs在肝纤维化形成中的作用及机制将有助于为肝纤维化防治提供新的干预靶点。

1 m iRNAs对肝损伤反应的调控作用

新近研究显示慢性肝损伤期间可出现miRNAs表达异常，这些异常表达的miRNA可调控肝脏对损伤刺激的反应。Lee等［5］探讨了miR-199-3p在慢性肝损伤中的作用。研究发现重度肝纤维化患者肝组织miR-199-3p表达水平明显上调;miR-199-3p可通过下调靶蛋白肝脏激酶B1(liver kinase B1，LKB1)诱发肝细胞线粒体功能障碍及氧化应激，加重肝损伤反应。因此，下调miR-199-3p可能减轻肝损伤反应的一个治疗靶点。Hou等［6］将let-7b/c表达载体转染Huh-7(人类肝癌细胞株)，发现let-7可保护Huh-7细胞抵御氧化乙酸诱导的肝损伤，机制与let-7上调亚铁血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)表达有关。Sarma等［7］探讨了miR-449a在慢性丙肝发病机制中的作用，研究发现丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染者肝组织miR-449a表达明显下调;miR-449a可通过上调靶蛋白NOTCH1抑制肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达，进而减轻HCV感染诱发的肝损伤反应。因此，慢性肝损伤期间出现的miRNAs差异表达既是一种客观现象，更是一种调节肝损伤修复反应的机制。

2 m iRNAs对肝损伤修复反应的调控作用

肝纤维化是肝脏对各种慢性肝损伤的一种修复反应，HSC是肝纤维化形成中的一种关键效应细胞。日益增加的证据显示:差异性表达的miRNAs可通过影响促纤维化信号通路及HSC活化迁移、增殖和凋亡，调控肝纤维化发生发展过程。

2．1 m iRNAs对HSC激活的调控作用 Chen等［8］应用基因本体论及基因本体图谱网络分析技术证实miRNAs可以促使定居于肝脏Disse间隙的HSC迁移至炎症部位并活化为能分泌ECM的肌成纤维细胞;并发现HSC活化及迁移与HSC内miR-335下调显著相关。进一步研究揭示miR-335调控HSC活化及迁移的机制与其下调靶基因细胞黏合素(tenascin，TN)C表达有关。Noetel等［9］报道在大鼠原代HSC自发激活过程中，miR-9、miR-125b及miR-128表达明显上调;应用miRNAs芯片技术，作者证实miR-9、miR-125b及miR-128可通过与趋化因子及受体家族mRNA结合，参与调控HSC自发活化过程。Li等［10］探讨了miR-122在肝纤维化中的作用，研究发现活化HSCs及实验性肝纤维化小鼠肝组织miR-122表达明显减少;并证实miR-122可通过下调4-脯氨基脱氢酶亚单位α1抑制HSC激活。

2．2 m iRNAs对HSC增殖的调控作用 Wang等［11］研究了miR-181a/b对HSC T6增殖的影响。研究发现miR-181a/b(尤其是miR-181b)在经转化生长因子(transfer growth factor，TGF)β1处理的HSC T6中表达明显上调;并证实miR-181b可通过调控细胞周期调节因子 p27促进HSC增殖。Iizuka等［12］探讨了 miR-214-5p在肝纤维化中的作用，研究发现丙型肝炎肝硬化患者及肝纤维化大鼠肝组织中miR-214-5p表达明显上调;并证实miR-214-5p过表达可激活TGF-β信号通路，其机制与上调转录因子Twist-1表达有关。He等［13］发现miR-146在TGF-β1诱导的HSC活化中表达下调;将miR-146转染至活化HSC显示:活化HSC α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达下调，HSC增殖减少、凋亡增加。生物信息学分析显示:miR-146调控HSC活化、增殖及凋亡的机制可能与调节Smad4有关。Venugopal等［14］研究了miR-150和miR-194对HSC增殖的影响。研究发现与来自假手术组大鼠相比，来自肝纤维化大鼠HSC的miR-150及miR-194表达明显减低;应用生物信息学分析发现，miR-150和miR-194可分别通过下调C-myb和rac1表达抑制HSC增殖。Zheng等［15］发现活化HSC miR-150表达明显减低;通过与Sp1和IV型胶原α4亚单位(Col4A4)结合，miR-150可抑制LX-2细胞I型胶原和IV胶原基因表达。

2．3 m iRNAs对HSC凋亡的调控作用 Guo等［16］对比研究了大鼠原代HSC与活化HSC miRNAs表达谱变化，发现在HSC活化过程中有12种miRNAs表达上调，9种miRNAs表达下调。应用Hoechst-33258、流式细胞技术，研究证实miR-15b和miR-16可通过抑制Bcl-2表达，激活caspases-3、8、9诱导HSCs凋亡。Wei等［17］探讨了miR-21对HSC的调控机制。PTEN(hosphatase and tensin homologue，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因)是miR-21的靶基因，是一种AKT激酶抑制剂，具有抑制HSC活化并诱导HSC凋亡的作用;研究发现促纤维化细胞因子血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)BB可诱导HSC miR-21表达上调;miR-21可通过抑制靶基因-PTEN表达，激活 AKT激酶，由此促进 HSC激活。

2．4 m iRNAs对肝纤维化形成的调控作用 Lakner等［18］研究miR-19b对HSC表型转化的调控作用。研究发现来自大鼠及人的活化HSC miR-19b表达明显下调;转染miR-19b至活化HSCs可使HSC由活化状态逆转为静息状态;miR-19调控HSC表型转化的机制与其下调TGF-βⅡ受体及Smad3表达，抑制TGF-β信号通路有关。Li等［19］探讨了miR-29及家族成员在肝纤维化中的作用。他们以人工合成的核受体FXR特异性激动剂(GW4064)处理活化HSCs，结果显示miR-29a表达显著上调，而包括I/Ⅲ型胶原基因、弹性蛋白及原纤蛋白在内的ECM基因的mRNA表达明显下调，提示miR-29a可抑制ECM基因mRNA的翻译过程。miR-29b也可通过多种方式参与肝纤维化调控［20］。Kwiecinski等［21］发现:经肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)处理的大鼠活化HSCs miR-29a/b表达明显上调，I型和IV型胶原表达下调; miR-29a/b可调控HSC由活化表型转变为静息表型。上述研究结果表明miR-29及家族成员对肝纤维化形成具有重要的调控作用。

Murakami等［22］研究了miR-199a/a*和miR-200a/ b在肝纤维化中的作用。研究发现这两种miRNA在CCl4诱导实验性肝纤维化小鼠及慢性丙型肝炎患者肝组织中表达明显上调，且上调水平与肝纤维化进展明显相关。应用基因芯片技术，证实静止LX-2细胞和正常肝组织miR-199a/a*和miR-200a/b呈低表达;转染miR-199a/a*和miR-200a/b至LX-2细胞，细胞内促纤维化相关基因表达显著上调。应用TGF-β处理LX-2细胞，发现miR-199a/a*和miR-200a/b表达明显上调;研究结果表明miR-199a/a*和miR-200a/b参与了肝纤维化发生与发展过程。

3 血清m iRNAs水平变化与肝功能储备的关系

临床研究显示:慢性肝病及肝硬化患者血清中存在miRNAs异常，这些异常的miRNA可能与肝功能储备相关，因此，miRNAs可能是评估肝功能储备的一类新型分子标志物。Gui等［23］研究了血清miR-885-5p水平变化对肝功能储备的评估作用，并与临床常用的肝功能生化指标ALT、AST、GGT进行比对分析。研究对象包括24例健康对照、17例非肝脏疾病对照患者(胃癌患者)、26例肝硬化患者、46例肝细胞癌患者以及23例慢性乙型肝炎患者;应用线性回归分析，发现miR-885-5p水平与肝功能储备呈明显正相关，miR-885-5p既不受血清ALT、AST及GGT影响，也与ALT、AST及GGT无相关性;提示血清miR-885-5p水平变化可作为评估肝功能储备的独立指标，是常用肝功能评价指标的有益补充。Waidmann等［24］研究了血清miR-122水平变化对肝硬化并发症及死亡发生的预测效果。研究对象包括17例肝硬化代偿期患者和90例失代偿期患者，结果显示血清miR-122在肝硬化失代偿期患者明显低于代偿期患者;有腹水、自发性细菌性腹膜炎或肝肾综合征等并发症的患者明显低于没有并发症的患者。应用Cox多元回归分析显示血清miR-122变化与Child-Pugh及MELD评分系统具有明显的相关性。MELD常用于评估肝硬化患者3个月内死亡的风险，也可用于预测急性出血、肝肾综合征等并发症的发生，以便评估哪些患者应该优先分配肝源进行肝移植; Waidmann等［24］认为miR-122可作为MELD的有益补充，用于评估肝硬化并发症发生风险及3个月以上的生存率。Roderburq等［25］探讨了肝硬化患者血清miRNAs变化规律。研究对象为65例肝硬化患者，结果发现肝硬化患者血清miR-513-3p和miR-571水平明显增加，而miR-652水平下降。以TGF-β处理分离的原代肝细胞和原代HSCs，发现这两种细胞miR-571表达均明显上调;提示肝硬化时血清中miR-571主要来源于肝细胞和HSCs，而miR-652水平下降可能与循环中单核细胞减少有关。血清 miR-513-3p、miR-571和miR-652改变在肝硬化发生发展中的作用仍有待进一步研究。

4 展望

miRNAs作为重要的转录后调控因子，已受到许多研究者的关注。慢性肝损伤期间出现的miRNAs表达异常既是一种客观现象，更是一种调控肝损伤修复反应的机制。深入研究肝纤维化形成过程中差异性表达的miRNAs并探究其功能，不仅将为肝纤维化防治提供新的干预靶点，而且可获得动态评估肝功能储备的新型分子标志物。相信在不久的将来，监测血清miRNAs变化可能成为评估肝纤维化程度及肝功能储备的一种新方法，干预miRNA表达可能成为肝纤维化防治的一种新策略。

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