铜绿假单胞菌耐药机制的研究进展▲

梁宏洁 闫玉兰

(广西医科大学第一附属医院检验科，南宁市 530021)

·综 述·

铜绿假单胞菌耐药机制的研究进展▲

梁宏洁 闫玉兰

(广西医科大学第一附属医院检验科，南宁市 530021)

铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，也是引起院内感染的主要致病菌之一。由于铜绿假单胞菌具有先天和后天获得耐药性，其对多种抗生素包括碳青霉烯类抗生素的耐药率不断上升，临床治疗越来越困难。铜绿假单胞菌的耐药机制复杂，包括β-内酰胺酶的产生、主动外排系统的表达、外膜蛋白的缺失、氨基糖苷钝化酶的产生、药物作用靶位改变、整合子的存在、生物被膜的形成等。

铜绿假单胞菌；耐药机制；多重耐药；综述

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种常见的条件致病菌，因其对多种抗菌药物耐药，临床治疗十分困难。碳青酶烯类抗菌药物是一类高效广谱的β-内酰胺类抗菌药物，对大多数β-内酰胺酶稳定，与三代头孢菌素无交叉耐药性，与青霉素结合蛋白的亲和力强，能够有效渗透细菌外膜进入细菌内，具有杀菌活性强大等特点，是控制临床感染性疾病最有效的药物之一[1，2]。由于近年来包括碳青霉烯类在内的广谱抗菌药物的广泛应用，铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药率不断升高，其耐药谱也越来越广[3，4]，铜绿假单胞菌已经成为临床控制感染的难点。为探讨铜绿假单胞菌耐药性原因，促进抗菌药物的合理应用，指导临床微创技术围术期的临床用药，本文对铜绿假单胞菌耐药机制的研究现状进行综述。

1 外膜通透性下降及外膜蛋白突变或缺失

铜绿假单胞菌的细胞膜上有多种微孔通道蛋白，也叫外膜蛋白，其中OprC、OprD2和OprE属于小通道微孔蛋白，一部分分子质量较小的亲水性物质如糖类、部分抗菌药物等能够通过[5，6]。当外膜蛋白上的小通道微孔蛋白发生基因突变或者缺失，造成细菌外膜对抗生素的通透性下降，抗菌药物不能通过，例如亚胺培南要经铜绿假单胞菌的微孔蛋白OprD2才能进入菌体，当OprD2基因发生突变或丢失时，亚胺培南不能通过OprD2进入铜绿假单胞菌体内杀灭细菌，表现为细菌对亚胺培南耐药[7，8]。

沈继录等[9]提取铜绿假单胞菌外膜蛋白进行SDS-PAGE，发现亚胺培南耐药株的外膜蛋白D2明显低于亚胺培南敏感株，说明铜绿假单胞菌中外膜蛋白表达量的减少或缺失可能是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制。Yoneyama等研究了外膜蛋白D2缺失并且对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌菌株，当实验人员将外膜蛋白D2基因导入到细菌中，可以恢复该菌株外膜蛋白D2的表达，对亚胺培南由耐药变成了敏感[10]。国外学者研究发现[11，12]，oprD2基因缺失存在缺失突变，编码区395～405位DNA片段小缺失，导致移码突变，形成新终止密码子，进而引起其肽链异常，最终导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药。

2 β-内酰胺酶的产生

铜绿假单胞菌可以产生多种β-内酰胺酶(β-lactamases，BLA)，导致其对β-内酰胺酶类抗生素耐药[13]，该菌产生的β内酰胺酶主要包括金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs)、超广谱β-内酰胺酶(extend-spectrum β-lactamases，ESBLs)、头孢菌素酶(AmpC酶)。

2.1 金属β-内酰胺酶 铜绿假单胞菌的金属β-内酰胺酶有多种，国内外学者研究发现分为以下几个类型：IMP、VIM、SPM、GIM、AIM，其通过与金属离子(主要为Zn2+)结合而发挥其催化活性。IMP型和VIM型是铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶的主要类型，均有20余种亚型，分别由相应编码基因中不同位点发生突变而来[14]。编码金属酶基因位于铜绿假单胞菌的染色体或者质粒上，并能通过转化、传导等不同方式在细菌之间进行传播，从而导致细菌耐药性传播。

2.2 超广谱β-内酰胺酶 铜绿假单胞菌可产生质粒介导或位于染色体上的超广谱β-内酰胺酶，能水解β-内酰胺类抗菌药物和单环β-内酰胺类抗菌药物，他唑巴坦、克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂可抑制其活性。铜绿假单胞菌产生的ESBLs主要有PER-1、PER-2、VEB-1和OXA-14等，主要由基因位点突变衍生而来，基因突变能改变β-内酰胺酶与头孢菌素的结合，消除其阻遏作用，从而抑制和水解三代头孢菌素；ESBLs基因的连续突变可以从本质上增强该酶的活力，使新一代的头孢菌素灭活[15]。编码ESBLs的基因大多数位于质粒上，细菌能通过不同方式使ESBLs基因在不同的质粒和染色体之间转移、传播，细菌还能将这些耐药基因进行特异性整合和重组，导致细菌发展为多重耐药；更有甚者，细菌也能将ESBLs基因通过染色体基因垂直传播，使子代也获得耐药基因，这也让铜绿假单胞菌的耐药情况更为复杂[16，17]。

2.3 头孢菌素酶 头孢菌素酶又称AmpC酶，是作用于头孢菌素且不被克拉维酸抑制的β-内酰胺酶，按Bush功能分类属于第一组β-内酰胺酶。铜绿假单胞菌中的AmpC 酶分为非诱导型和诱导型酶，在正常情况下因为没有诱导剂作用，其表达水平很低，但在大量使用诱导剂如第三代头孢菌素等β-内酰胺类抗生素后，头孢菌素类药物可通过去阻遏作用诱导，其表达水平大大增加[18，19]。产AmpC酶的铜绿假单胞菌对大多数β-内酰胺类抗生素耐药，能水解1～3代头孢菌素类药物和头霉素类药物。

3 主动外排系统的表达

铜绿假单胞菌的细胞膜上具有药物外排系统，可将抗生素主动排出体外，并且与其外膜蛋白的突变或缺失起协同作用，最后导致铜绿假单胞菌对多种抗菌药物耐药。

铜绿假单胞菌存在于MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM等7种主动外排系统，其中最常见的是MexAB-OprM系统[20，21]。主动外排系统底物较广泛，MexAB-OprM系统能转运大量的β-内酰胺类抗生素，其中MexA和MexB是识别β-内酰胺类药物的决定因子。MexB能捕获经外膜蛋白进入膜间隙并结合在内膜外侧的β-内酰胺类抗生素，然后借助MexA辅助蛋白的桥联作用，经OprM将药物排出胞外[22]；MexCD-OprJ系统的转运底物为第四代头孢菌素；MexEF-OprN能将碳青霉烯类药物泵出，但却不能泵出常见的β-内酰胺类抗生素及第四代头孢菌素药物。

随着广谱抗菌药物的大量使用，以及医院使用消毒剂种类的增加，能够通过细菌外排泵泵出的底物也将随之增加，铜绿假单胞菌的外排系统类型也会越来越多，可能导致细菌对更多的药物耐药，加上各种耐药基因在不同细菌之间的传播，铜绿假单胞菌的耐药形势将会更为严峻[23]。

4 氨基糖苷类钝化酶的产生

铜绿假单胞菌产生的氨基糖苷类钝化酶(aminoglycoside inactivating enzymes)也称氨基糖苷类修饰酶，可使细菌对庆大霉素、阿米卡星等氨基糖苷类抗菌药物耐药。该酶能修饰氨基糖苷类抗生素的氨基或羟基而使其结构破坏，经钝化酶作用后的药物与未经钝化的药物竞争细菌的细胞内转运系统，导致该类药物减少或者不能与核糖体紧密结合，从而失去抗菌活性[24]。钝化酶的种类主要有：氨基糖苷磷酸转移酶(aminoglycoside phos-photransferases，APH)，对羟基进行磷酸化修饰；氨基糖苷乙酰转移酶(aminoglycoside acetyltransferases，ACC)，对氨基进行乙酰化修饰；氨基糖苷类核苷转移酶(aminoglycoside nucleotidyltransferases， ANT)，对羟基进行核苷转移。氨基糖苷类钝化酶可以和MBL、ESBLs等共同存在于细菌质粒或染色体的整合子和转座子上，导致多重耐药性在细菌之间相互传播[25]。

5 整合子的存在

整合子在铜绿假单胞菌耐药基因的获得与传播中具有重要的作用。整合子是一种运动性的遗传物质，可对外源性基因进行捕获、整合，转变为能够表达功能性基因的DNA分子。根据整合酶基因和捕获基因盒的能力不同，将已发现的整合子分为6类，其中1～4类整合子在细菌的耐药性传递上发挥着重要的作用。整合子本身不能移动，但可整合到质粒或染色体上，或者自身作为转座子的组成部分使耐药基因在细菌的种内和种间进行传播。整合子能通过携带位点特异性重组系统基因片段，使整合酶从周围环境捕获耐药基因盒并将其组装在一起，形成巨大的耐药基因多基因座，使细菌具有多重耐药性，其在多重耐药铜绿假单胞菌耐药基因的播散中起主要作用[26]。

6 改变药物的作用靶位

青霉素结合蛋白(penicillin binding protein，PBPs)位于细菌细胞膜上，主要参与细菌细胞壁肽聚糖的合成，使细菌细胞壁保持正常形态和功能，是β-内酰胺类抗生素作用的重要靶位。β-内酰胺类药物的作用机制之一是与细胞膜上的PBPs结合，使细胞壁合成受阻，细菌不能维持其形态与功能从而溶解、死亡。铜绿假单胞菌能使PBPs发生基因突变，使其结构发生改变，与β-内酰胺类抗生素(如亚胺培南等)的亲和力减低或消失，导致铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药。国外学者在对亚胺培南和美罗培南耐药的铜绿假单胞菌研究中发现，PBPs在参与诱导AmpC 酶产生中发挥了一定的作用[27，28]。

DNA拓扑异构酶结构改变是铜绿假单胞菌对喹诺酮类耐药的机制，喹诺酮类药物主要作用于拓扑异构酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ。拓扑异构酶Ⅱ能催化DNA逆向超螺旋，由2个gyrA基因编码的A亚基和2个gyrB基因编码的B亚基组成；拓扑异构酶Ⅳ是由两个parC基因编码C亚基和2个parE基因编码的E亚基组成，gyrA基因和parC基因突变都能造成铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药[29]。Akasaka T等[30]研究发现，在临床分离的铜绿假单胞菌耐药株中gyrA的突变点占79.3%，说明拓扑异构酶结构改变在喹诺酮类抗生素耐药性的产生中具有重要作用。

7 生物膜的形成

铜绿假单胞菌极易形成生物膜(biofilm，BF)。生物膜是附着在菌体表面的一种多糖蛋白复合物，具有一定的柔韧性和厚度，对细菌发挥保护作用，能阻止化学杀菌剂的活化，阻止抗生素进入被膜底层，使底层细菌对抗菌药物产生非常强的耐药作用；生物膜也能使细菌附着在支持物表面，不易被流动体液推走，能抵抗宿主免疫细胞、免疫分子和抗菌药物的攻击，使细菌生命力更持久，其传递毒力基因和耐药基因的能力也大大增加[31]。

8 小 结

铜绿假单胞菌的耐药机制极为复杂，天然耐药、获得性耐药、选择性耐药并存，既可由单一耐药机制引起，也可以由多种耐药机制共同作用而成。铜绿假单胞菌作为临床上常见的医院感染病原菌，其耐药机制还需要更深入广泛的研究，以寻找更有效的手段降低其耐药性，例如研究某些物质来抑制外膜主动外排系统、更有效的β-内酰胺酶抑制剂、减少或去除生物被膜的形成等。目前，铜绿假单胞菌的抗感染治疗应注重抗菌药物的合理应用，以此来提高抗菌药物的治疗效果。

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Researchadvanceinantimicrobialresistancemechanismsofpseudomonasaeruginosa

LIANGHongjie,YANYulan

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,Guangxi,P.R.China)

Pseudomonas aeruginosa(PA) is a common opportunistic pathogen as well as one of the main pathogens causing nosocomial infections. The clinical treatment of PA infection is becoming difficult gradually for its congenital and acquired drug resistance and its increasingly high resistance rate of many antibiotics including carbapenem. Mechanisms of drug resistance of PA are complex, which include production of β-lactamases, expression of active efflux systems, lack of outer membrane proteins, production of aminoglycoside modifying enzymes, changes of antimicrobial targets, existence of integrons, and biofilms forming,etc.

Pseudomonas aeruginosa; Resistance mechanisms; Multi-drug resistant;Review

广西自然科学基金(桂科自2010GXNSFA013172)；广西区卫生厅科研项目(桂卫Z2010371)

梁宏洁(1970～)，女，博士，副主任技师，研究方向：临床微生物检验。

R 446.5

A

1673-6575(2014)02-0200-04

10.11864/j.issn.1673.2014.02.25

2014-01-03

2014-03-06)