FLT3基因突变对急性髓系白血病的影响

朱柏贵， 张苏江， 李建勇，高鸿敏

FLT3基因突变对急性髓系白血病的影响

朱柏贵1， 张苏江2， 李建勇2，高鸿敏3

目的探讨FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosie kinase3,FLT3)基因突变对急性髓细胞样白血病(acute myeloid leukemia,AML)的影响。方法采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)结合直接测序和克隆测序对50例初诊AML患者FLT3突变进行研究，并结合临床资料进一步分析。结果正常核型AML患者FLT3基因内部串联重复(internal tandem duplication,ITD)阳性检出率20%，高于异常核型(6.25%)；与野生组相比，FLT3-ITD(+)突变患者初诊时白细胞计数、血红蛋白及骨髓原始细胞比例均高，缓解率低。结论FLT3突变是正常核型AML患者的主要分子标志，其对疾病预后及靶向治疗具有重要意义。

FMS样酪氨酸激酶3；急性髓系白血病；基因突变

急性白血病患者的染色体核型分析为疾病治疗反应和生存预后提供了非常重要的生物学信息。近年来，学者指出多种分子标记物与疾病具有显著的预后相关性，并有利于急性白血病更加精细的分类和预后评估。FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosie kinase3,FLT3)基因内部串联重复(internal tandem duplication, ITD)是AML患者中发现的常见突变类型，其在AML中的发生率可达15%～35%。研究显示，FLT3突变与外周血高白细胞，骨髓高白血病细胞比例有关，是影响AML预后的重要因素[1，2]，FLT3第二酪氨酸激酶结构域(tyrosine kinase domain, TKD)点突变主要是835和836位氨基酸的点突变，其发生率较于FLT3-ITD为低，其预后意义尚存在争议。本研究旨在进一步探讨FLT3突变在AML患者中的发生情况，分析其临床特征、疗效及与预后的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2010-04至2013-01于南京医科大学第一附属医院诊治的50例初诊AML患者。其中男27例,女23例；中位年龄43岁(8～76岁)。所有患者均经过骨髓细胞形态学、免疫表型、染色体和融合基因检查确诊，参照FAB标准及WHO标准：M01例,M14例,M220例,M38例,M46例,M57例,M64例。5名正常对照为南京医科大学第一附属医院体检正常者。

1.2 方法

1.2.1 染色体核型分析 50例病例标本应用R显带技术进行核型分析，治疗前抽取患者的骨髓5 ml，肝素抗凝，采用直接法及不加植物血凝素的短期培养法制备染色体标本，然后采取改良的热处理吉姆萨R显带技术分析20个以上分裂象细胞核型，核型按“人类染色体国际命名体制(ISCN2005)”进行描述。

1.2.2 基因组DNA提取 所有患者均在获得知情同意后抽取骨髓液5 ml用于常规免疫表型和细胞遗传学分析，剩余骨髓液用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，采用传统酚-氯仿抽提法提取DNA，应用紫外分光光度仪测定样本的OD值，去离子水稀释DNA至50 ng/μl，-20 ℃保存备用。

1.2.3 FLT3基因突变检测

1.2.3.1 FLT3-ITD突变检测 PCR扩增参照文献[3,4]方法,针对FLT3基因外显子14、15设计引物(上海英俊公司合成)，正义链：5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′；反义链：5′-CTTTCAGCATTT-TGACGGCAACC-3′。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72℃ 8 min，4 ℃保存。野生型扩增产物为329 bp处出现单一峰，ITD突变型扩增产物为在大于329 bp处出现特异性条带。FLT3-ITD电泳阳性标本克隆测序，测序结果与野生型基因序列比对。

1.2.3.2 FLT3-TKD点突变检测 PCR扩增，针对FLT3基因外显子20设计引物，扩增片段(479bp)包含D835和I836点突变所在区域。引物正义链：5′-GCTCGGAATCTGCAAAAGAT-3′，反义链：5′-CACCACAGTGAGTGCAGTTG-3′。反应条件同FLT3-ITD，酶切反应按照EcoRV(纽英伦生物技术有限公司)说明书进行操作，PCR扩增产物6 μl 中加入EcoRV内切酶6 U，10×EcoRV内切酶缓冲液2 μl，加灭菌双蒸水至终体积20 μl，37 ℃恒温反应3 h进行酶切反应，酶切结束后2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，于凝胶成像仪的紫外光下观察目的条带。FLT3基因的编码D835和I836的GATATC序列可被EcoRV识别酶切，若D835和I836的任一位置发生点突变的标本发生改变，则EcoRV不能酶切该序列。对FLT3-TKD(+)标本进行PCR扩增，送上海英俊公司进行测序验证。

1.2.4 克隆测序 选取琼脂糖电泳FLT3-ITD突变型标本，对PCR扩增产物进行回收并纯化，用pUCm-T载体(上海英俊公司产品)进行克隆测序(上海英俊公司完成)，结果与正常序列比对分析突变发生的位置和类型。

1.3 统计学处理 采用SPSSA16.0统计学软件进行分析，采用χ2检验进行差异性检验，计量资料采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FLT3-ITD突变分析 正常健康对照者琼脂糖电泳分析显示在329 bp处出现单一条带，50例初诊AML患者中5例FLT3-ITD突变阳性，男2例，女3例。中位年龄43(7～67)岁。对其中3例阳性样本进行克隆测序显示：ITD片段长度不等，重复区域各不相同，均为框内突变。

2.2 FLT3-TKD点突变分析 50例中FLT3-TKD(+)2例(4%)，其中1例为D835 Y，天冬氨酸变为酪氨酸，另1例为I836 M，均为杂合突变。

2.3 染色体核型分析 50例AML患者染色体核型分析结果显示，14例无分裂相，在20例正常核型中FLT3-ITD(+)4例(20%)，FLT3-TKD(+)1例；而16异常核型患者FLT3-ITD(+)1例(6.25%)，FLT3-TKD(+)2例(12.5%)。FLT3-ITD基因突变在正常核型发生率高于异常核型，但两者差异无统计学意义。1例FLT3-ITD基因突变异常核型为t(15;17)，2例发生FLT3-TKD突变的异常核型AML患者中分别是inv(16)和t(15;17)。

2.4 FAB亚型分析 FLT3基因突变可发生FAB的多个亚型，5例FLT3-ITD(+)患者中M1、M2、M4、M5、M6各1例，3例FLT3-TKD(+)患者中M3、M2、M4各1例。

2.5 临床特征分析及预后 排除FLT3-TKD(+)干扰，将患者按FLT3-ITD突变情况分为FLT3-ITD(+)、FLT3-ITD(-)两组进行分析，各组临床数据见表1。与FLT3-ITD(-)组相比，FLT3-ITD(+)突变组患者初诊时白细胞计数、血红蛋白、血小板计数及骨髓原始比例均高于正常健康对照组，但差异无统计学意义。在发病年龄及性别比例上，FLT3-ITD(+)组患者发病年龄与正常健康对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)。将可随访预后的30例患者分为FLT3-ITD(+)、FLT3-ITD(-)两组，其CR率分别是40%(2/5)、68%(17/25)，中位随访时间9个月(1～18个月)。

3 讨 论

AML是造血系统的具有细胞遗传学和分子遗传学的一种异质性疾病。在AML的发病中，细胞遗传学改变是判断预后的重要依据，往往出现染色体异常，有40%～50%的AML患者细胞遗传学特征为正常核型。对于正常核型的AML，在诊断、预后分层和微小残留病灶的监测是目前遇到的一大难题，因此，一些特征性基因突变对于亚型分类和预后评估有着重要的意义。FLT3是Ⅲ类酪氨酸激酶受体的一种，后者包括PDGF-R，KIT和FMS，并在造血祖细胞的早期增殖分化阶段起重要作用。FLT3基因突变可导致配体独立的二聚体形成和酪氨酸自磷酸化作用，进而激活其下游RAS/MAPK，STAT5和PI3K/AKT异常的信号转导途径，促进细胞增殖和抑制凋亡，推测其与AML的发生及复发有关。

目前，多项研究显示，FLT3基因，尤其是ITD突变与AML患者的临床表现及预后相关[1-3]。本研究在50例AML患者中共检出FLT3-ITD(+)5例(10%)，FLT3-TKD(+)2例(4.0%)，发生率较文献[1,2]报道少，可能与样本量少及琼脂糖电泳检测方法敏感度有关。本研究结果也显示，正常核型AML患者FLT3-ITD(+)检出率20%，高于异常核型(6.25%)，与正常健康对照组相比，FLT3-ITD(+)突变患者初诊时白细胞计数、血红蛋白及骨髓原始细胞比例均高，缓解率低，预后差，在发病年龄及性别比例上无明显差异，与其他研究结果一致[3-5]。有学者认为，伴有FLT3-ITD(+)突变的AML患者的总生存期(OS)、无病生存期(DFS)均缩短[6]。由于随访时间较短，本研究未作此方面的统计。FLT3-TKD突变的预后影响还处于争议中，Mead A等[7]报道年轻AML患者FLT3-TKD突变多伴白细胞增高，但在具预后差、细胞遗传学异常的AML患者中罕见，本研究与此报道一致。

本研究分析，FLT3-ITD(+)、FLT3-ITD(-)两组CR率结果显示，FLT3-ITD(+)AML的CR率较FLT3-ITD(-)AML患者低。与国外研究结果一致[6]。LT3突变在原发性AML，尤其是正常核型AML患者中有着较高的发生率。已有文献[8]报道，FLT3-ITD(+)患者单独使用化疗疗效较差(合并NPM1突变以及FLT3突变等位基因比例较低的疗效较好)，FLT3-ITD(+)患者首次完全缓解后早期(而不是在进行多次巩固化疗后)行异基因造血干细胞移植是最佳的选择，与化疗或自体造血干细胞移植相比，能够使无病生存期延长3～5年，并降低复发率。针对FLT3基因突变的靶向治疗已逐步应用于临床[9]，为诊断和治疗AML提供了新的手段和策略[10]。因此，临床上筛查FLT3基因突变对AML患者治疗及预后均有指导意义。

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(2013-11-28收稿 2014-01-16修回)

(责任编辑 郭 青)

EffectofFLT3genemutationsonacutemyeloidlecukemia

ZHU Baigui1, ZHANG Sujiang2, and LI Jianyong2. 1.Department of Hematology, Jiangsu Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Yangzhou 225003, China. 2. Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029, China; 3.Department of Respirqtory, 263 Hospital Clinical Division General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China

ObjectiveTo study the influence of FLT3 gene mutation on acute myeloid leukemia(AML).MethodsWe used PCR combined with direct sequencing and cloning sequencing to investigate FLT3 mutation in 50 AML patients, and further analyzed clinical data of these patients.ResultsFLT3-ITD mutation was found in 20% AML patients with normal karyotype, which was higher than that in patients with abnormal karyotype. Compared with wild-type group, the WBC count, hemoglobin and blast cells in bone marrow were all high in FLT3-ITD positive group which with lower CR ratio.ConclusionsFLT3 mutation is the major molecular marker of AML patients with normal karyotype, which is very important for prognosis analysis and targeted therapy of AML.

FMS-like tyrosine kinase3; acute myeloid leukemia; mutation

朱柏贵，本科学历，主任医师，E-mail：zhubogui@163.com

1.225003扬州，武警江苏总队医院血液科；2.210029，南京医科大学第一附属医院血液科；3.100700，北京军区总医院263临床部呼吸科

高鸿敏，E-mail: gaohongmin1975@126.com

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