近江牡蛎糖胺聚糖毒理学的初步评价

胡雪琼，吴红棉，范秀萍，蒋 杨

（广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

近江牡蛎糖胺聚糖毒理学的初步评价

胡雪琼，吴红棉*，范秀萍，蒋 杨

（广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，国家贝类加工技术研发分中心（湛江），广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

目的：研究近江牡蛎糖胺聚糖作为保健食品使用的安全性。方法：采用急性毒性实验、遗传毒性实验（Ames实验、小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠精子畸形实验）进行毒理学研究与评价。结果：小鼠经口最大耐受剂量（MTD）均大于20.0g/kg；3项遗传毒性实验的结果皆为阴性，未显示出致突变性。结论：近江牡蛎糖胺聚糖急性毒性分级属无毒级，无遗传毒性。

近江牡蛎，糖胺聚糖，毒理学

近江牡蛎（Crassostrea Rivularis），牡蛎科或燕蛤科双壳类软体动物，分布于温带和热带各大洋沿岸水域[1]，其肉质鲜美、营养丰富，历来备受世人推崇。牡蛎含维生素、微量元素、蛋白质、牛磺酸等多种营养成分，对人体具有提高免疫力、降血脂、促进新陈代谢、改善高血糖症状等功能，对抗癌和防止癌细胞扩散也有一定效果[2]。

本实验室前期对近江牡蛎糖胺聚糖增强免疫力的功能学检验结果表明：细胞免疫、单核巨噬细胞、抗体生成数和血清溶血素、NK细胞的杀伤活性均为阳性，表明其具有免疫增强功能[3]。本研究依据《保健食品检验与评价技术规范》[4]对近江牡蛎糖胺聚糖（Crassostrea Rivularis Glycosaminoglycan）进行毒理学评价，旨在为近江牡蛎糖胺聚糖用作保健食品及药品提供科学的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

近江牡蛎全脏器经双酶酶解[5]、醇沉、脱色和等电点除蛋白和超滤脱盐浓缩，得到精制品CG 由本实验室提取制备；SPF级KM小鼠（合格证号：SCXK（湘）2009-0012） 湖南省长沙市天勤生物技术有限公司提供；实验动物室温度 22～25℃，相对湿度：55%～70%；组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）TA97、TA98、TA100和TA102广东省疾病预防控制中心卫生毒理所惠赠，均置于-80℃保存；酚胺磺（Dexon）、叠氮化钠（SA）、2-氨基芴（2-AF）、大鼠肝微粒体酶悬液（S9） 汇智泰康生物技术（北京）有限公司；小牛血清 杭州四季青生物有限公司；Giemsa贮备液 A Fisher ScientificWorld Company；伊红染色液 广州市中南化工有限公司；营养肉汤培养基BD；琼脂粉 天津市福晨化学试剂厂；D-生物素、葡萄糖-6-磷酸钠盐 MDBIO. INC；L-组氨酸 中国新兴化工试剂研究所；二甲基亚砜 天津高宁精细化工有限公司；环磷酰胺CTX江苏恒瑞医药股份有限公司。

PHX型生化培养箱 宁波莱福科技有限公司；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜 苏州安泰空气技术有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台 苏州净化有限公司；JJ1006型电子天平 中国双杰集团有限公司；MS3迷你振荡器、德国IKA；OLYMPUS CK2型倒置显微镜、OLYMPUS CH30型生物显微镜 日本OLYMPUS公司；全自动血液生化分析仪 意大利Echo公司；MEK-7222K型全自动血球计数仪 日本光电公司；TS-12N型生物组织全自动脱水机、BM-VII型生物组织包埋机及冷冻机、CS-VI型摊片烤片机、RS-18型生物组织全自动染色机 湖北孝感医用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒性实验 选取18～22g健康KM小鼠20只，雌雄各半。根据最大耐受剂量法，近江牡蛎糖胺聚糖粉末质量浓度为0.25g/mL。灌胃前24h禁食，于次日分4次灌胃（每次灌胃量为20mL/kg），灌胃总量达20.0g/kg，连续观察14d，记录中毒症状及死亡情况。1.2.2 遗传毒性实验

1.2.2.1 Ames实验 选用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102共4株实验菌株，采用平板掺入法，分加与不加S9混合液两种。受试物加热灭菌后，共设5个剂量组，分别为5000、1000、200、40、8μg/皿。同时设定1个双蒸水阴性对照组和3个阳性对照组（Dexon、SA、2-AF），各剂量组各菌株各做3个平行样，重复实验1次。在37℃条件下培养48h，计数每皿回变菌落数，求出每组平均菌落数。当受试物回变菌落数超过自发回变的2倍以上并有剂量-反应关系时即可判定为阳性。

1.2.2.2 小鼠骨髓红细胞微核实验 SPF级KM小鼠（25～30g）50只，随机分为5组。对照组给予相同体积蒸馏水；阳性对照组为环磷酰胺（CTX，50mg/kg）；CG高、中、低剂量组分别为10、5、2.5g/kg。采用2次经口给受试物，中间间隔24h，于第2次给受试物6h后处死动物，取一侧胸骨制备骨髓涂片。Gimsa染色后镜检计数嗜多染红细胞中的微核发生率（‰）。

1.2.2.3 小鼠精子畸形实验 SPF级KM小鼠（25～30g）50只，随机分为5组。对照组给予相同体积蒸馏水；阳性对照组为环磷酰胺（CTX，50mg/kg）；CG高、中、低剂量组分别为10、5、2.5g/kg（为人可能摄入量的100、50、25倍）。各组均按20mL/kg经口灌胃，每日1次，连续5d。首次给药后的第35d颈椎脱臼法处死小鼠，制备精子标本，1%伊红染色。高倍镜下观察，每只动物计数1000个精子，记录畸形精子数，计算精子畸变率（‰）。

1.3 数据处理

实验数据用x±S表示，应用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析和两两比较。

2 结果与分析

2.1 近江牡蛎糖胺聚糖急性毒性实验

在14d的观察期内，动物的活动及体质量增长正常，无一动物死亡；外观、体征、行为活动、精神状态、饮食、大小便等均未有异常改变；口、眼、鼻等处也无异常分泌物。经解剖小鼠，肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾、肠等脏器，与正常小鼠比较，皆未发现明显病变和差异。表明该受试物对雌、雄小鼠经口最大可耐受剂量（MTD）≥20g/kg。根据《保健食品检验与评价技术规范》附录D急性毒性剂量分级表的规定，近江牡蛎CG属无毒级。

表1 Ames实验结果（x±S，n=3）Table 1 Results of Ames tes（tx±S，n=3）

2.2 近江牡蛎糖胺聚糖遗传毒性实验

2.2.1 Ames实验 从表1可见，通过一般观察，发现各组各皿均未见细菌毒性表现及沉淀。菌落计数两次实验，结果均表明，阳性对照组TA97、TA98、TA100和TA102的回变菌落数与阴性对照组比较显著增加（p＜0.01）；近江牡蛎糖胺聚糖五个剂量组TA97、TA98、TA100和TA102的回变菌落数，无论有无S9活化系统，与阴性对照组相比无显著性关系，表明近江牡蛎糖胺聚糖无明显的突变作用。

因此，依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）和GB 15193.4-2003鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶实验评价标准判断，近江牡蛎糖胺聚糖在鼠伤寒沙门氏菌回复突变体系中未显示有致突变作用。

2.2.2 小鼠骨髓细胞微核实验 由表2可以看出，在两性小鼠中CG各剂量组的嗜多染红细胞数/成熟红细胞（PCE/RBC）与相应对照组相比无显著性差异；而且也未少于对照组的20%，表明CG未对骨髓细胞分裂产生抑制[6-8]。与对照组相比，两性小鼠的CTX组微核率均有极显著性差异（p＜0.01），表明发生了突变；两性小鼠的CG各剂量组微核率均无显著性变化（p＞0.05），且无剂量-反应关系。结果表明，CG对两性小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核发生率无影响。

表2 近江牡蛎糖胺聚糖对小鼠骨髓细胞微核的影响（x±S，n=10）Table 2 Effect of CG on micronucleus rate of mouse bone marrow polychromatic erythrocyte（x±S，n=10）

2.2.3 小鼠精子畸形实验 由表3可知，与对照组比，CTX组的畸变率有极显著升高（p＜0.01）；CG剂量组对小鼠精子畸形发生率未产生明显改变，各剂量组与对照组相比，无显著差异（p＞0.05）；表明CG无致小鼠精子畸形作用。

表3 近江牡蛎糖胺聚糖对小鼠精子畸形的影响（x±S，n=10）Table 3 Effect of CG on mouse sperm abnormality（x±S，n=10）

3 讨论

海洋动物中的多糖类物质具有较好的生物活性与应用价值，美国、欧洲、日本等采用现代生物、新型化学化工和食品加工高新技术，研究开发牡蛎的功能活性成分，已开发了保健疗效品、调味品及食品添加剂等产品[9]。尽管牡蛎在国内外均为常规食用的普通食品，且是国家卫生部规定的药食同源物品，并采用食品级酶与食品级酒精为提取剂，按常规工艺提取，但以提取的牡蛎糖胺聚糖用于生产保健食品，仍需进行毒理安全性评价。因此，根据毒理学实验的选择要求，我们以近江牡蛎糖胺聚糖粗品为研究对象，对其急性毒性、遗传毒性实验进行了研究。

上述动物实验结果表明，近江牡蛎糖胺聚糖对KM小鼠LD50大于20g/kg（以体质量计），且动物活动正常，未发现不良症状，根据急性毒性剂量（LD50）分级标准，该样品属无毒级。根据对遗传物质作用终点的差别，并兼顾原核细胞与真核细胞、体内实验与体外实验以及体细胞和生殖细胞相配套原则，进行了3项遗传毒性实验，即Ames实验、小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠精子畸变实验。实验结果表明3项遗传毒性实验结果皆为阴性，表明该受试物无致突变作用。本研究对近江牡蛎糖胺聚糖粗品的初步毒理学评价结果，为其在保健食品上的安全应用提供了依据。

4 结论

近江牡蛎糖胺聚糖粗品经口最大耐受剂量（MTD）大于20.0g/kg，属于无毒级食品基料；3项遗传毒性实验（Ames实验、骨髓细胞微核实验、小鼠精子畸形实验）结果均为阴性，表明其无遗传毒性、无致突变作用。

[1]王海艳，郭希明，刘晓，等.中国近海“近江牡蛎”的分类和订名[J].海洋科学，2007，31（9）：84-86.

[2]陈惠源，蔡俊鹏.牡蛎的营养药用价值及其开发利用[J].中药材，2005，28（3）：172-173.

[3]刘倩.近江牡蛎糖胺聚糖免疫调节作用及体外抗肿瘤活性的研究[D].湛江：广东海洋大学，2012.

[4]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].2003：177-242.

[5]胡雪琼，吴红棉，刘芷筠，等.近江牡蛎糖胺聚糖的酶解提取及其抗肿瘤活性研究[J].食品研究与开发，2009，30（7）：3-6.

[6]方佳，陈常庆.MTT比色法与3H-TdR掺入法测定rhIL-3和rhEPO生物学活性的比较 [J]．上海免疫学杂志，1996，16（2）：110-111.

[7]王道福.中药多糖免疫调节作用的研究进展[J]．实用医药杂志，2007，24（2）：235-237.

[8]陈奇主编.中成药名方药理与临床[M]．北京：人民卫生出版社，1998：546-547.

[9]曾庆祝，曾庆孝.海洋贝类（牡蛎、扇贝、文蛤等）功能性食品的开发利用[J].氨基酸和生物资源，2002，24（3）：31-34.

Toxicological evaluation of glycosaminoglycan from Crassostrea Rivularis

HU Xue-qiong，WU Hong-mian*，FAN Xiu-ping，JIANG Yang
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

Objective：The toxicological safety of glycosaminoglycan from Crassostrea Rivularis（CG）as a healthy food material was evaluation.Methods：Acute toxicity test，genetic toxicity test（Ames test，micronucleus test of born marrow in mice，sperm shape abnormality test in mice）were used in this study according to the procedures for toxicological assessment of food.Results：Acute toxicity test showed that the acute oral maximum tolerated doses（MTD）of CG to male and female rats were both more than 20.0g/kg body weight.All results of three genotoxicity tests were negative and no mutagenicity.Conclusion：Glycosaminoglycan from Crassostrea Rivularis（CG）was non-toxic substances based on the acute toxicity grading and non-genetic toxicity based on genotoxicity tests.

Crassostrea Rivularis；glycosaminoglycan；toxicology

R114

A

1002-0306（2014）08-0349-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.071

2013－09－26 *通讯联系人

胡雪琼（1970-），女，大专，高级实验师，研究方向：农海产品深加工。

广东省海洋渔业科技推广专项（A201008I02）。