南极磷虾壳中虾青素酯的皂化工艺研究

姜启兴，宋素梅，夏文水，刘富俊，许艳顺，刘冬梅，王海鸥，*

（1．江南大学食品学院，江苏无锡214122；2．辽宁省大连海洋渔业集团公司，辽宁大连116113）

南极磷虾壳中虾青素酯的皂化工艺研究

姜启兴1，宋素梅1，夏文水1，刘富俊2，许艳顺1，刘冬梅2，王海鸥1，*

（1．江南大学食品学院，江苏无锡214122；2．辽宁省大连海洋渔业集团公司，辽宁大连116113）

研究了南极磷虾壳中虾青素酯的皂化条件，以游离虾青素含量为指标，分析了粗提液浓度、皂化温度和碱浓度对皂化效果的影响。结果表明，粗提液浓度在0.1g/mL时，完成皂化所需的时间和碱浓度较为合适；皂化温度和碱浓度越高，完成皂化所需的时间越短，而损失也越大。最适皂化条件为，粗提液浓度0.1g/mL、皂化温度5℃、碱浓度0.020mol/L，皂化时间12h时，此条件下游离虾青素含量为55.75μg/mL。

南极磷虾壳，虾青素酯，皂化，虾青素

近年来，随着资源问题的日益严峻，远洋资源的开发利用成为各国争相研究的课题。据估计，南极磷虾的生物量为10.00亿吨，几乎遍布整个南极海域，资源极其丰富[1]。而虾青素是南极磷虾壳中含量比较丰富的活性成分，具有比较活跃的电子效应，极易与自由基反应，能有效清除体内的活性氧，具有超强的抗氧化活性。此外，虾青素还具有抗癌、增强免疫、促进生长繁殖等作用以及显著的着色能力，在食品、医药、化妆品和饲料等行业具有重要作用。目前，国内研究更多的关注在于南极磷虾肉中蛋白、脂溶性成分等的分离和应用[2]，国外则侧重于对酶、脂肪酸等的分离纯化及其性质分析[3-4]，对南极磷虾壳资源的研究较少。而虾壳大多作为废弃物丢弃，亟需有效的开发利用。

研究表明，虾青素主要以游离虾青素和虾青素酯的形式存在于虾壳中，约占虾壳中总类胡萝卜素的63.5%～92.2%，因虾种类而异[5]。通过皂化反应将虾青素酯转化为游离虾青素，是分离纯化虾青素，提高最终虾青素产品得率的重要手段。然而皂化条件控制不当，反而会引起虾青素的大量损失。因此，本文重点对影响虾青素得率的皂化条件进行研究，以获得较好的皂化工艺，减少皂化过程虾青素的降解损失。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

南极磷虾 由辽宁省大连海洋渔业集团公司提供，经采肉机采肉3次后得虾壳备用，用丙酮提取虾青素，溶剂蒸干后得到粗提的虾青素色素油[6]；虾青素标准样品（纯度≥97.1%） 德国Dr.Ehrenstorferg公司；丙酮、石油醚、乙醇、无水硫酸钠、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司，分析纯；二氯甲烷、甲醇、乙腈 国药集团化学试剂有限公司，色谱纯。

UV1000分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；薄层层析硅胶板（2.5cm×7.5cm） 山东青岛海洋化工有限公司；Waters1525高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、色谱柱Spherisorb®Silica（4.6mm× 250mm，5μm） 美国Waters公司；RZ-52AA旋转蒸发仪 配有SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；AB104-N电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虾青素酯的皂化流程 虾青素色素油→复溶→加皂化液→氮气顶吹→净置皂化。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 粗提液浓度对皂化效果的影响 粗提的虾青素色素油用无水乙醇溶解，分别配成色素油含量为0.05、0.1、0.2g/mL的粗提液5mL置于具塞试管中，分别加入1mL不同浓度（0.01、0.02、0.03、0.04mol/L）的NaOH-乙醇溶液，混匀，氮气吹扫至总体积5mL，于5℃避光静置。以正己烷-丙酮为展开剂（体积比75∶25）[7]，利用薄层层析板至少每0.5h检测一次，皂化液在薄层板上仅出现一个总类胡萝卜素点，且该点的Rf值与虾青素标样相同时，即为皂化终点，记录皂化时间。

1.2.2.2 皂化温度对游离虾青素含量的影响 取色素油含量0.1g/mL（总类胡萝卜素含量约72.5μg/mL）的粗提液5mL置于具塞试管中，加入0.020mol/L新配制的NaOH-乙醇溶液1.0mL，混匀，氮气吹扫至总体积5mL，分别置于5、15、25℃避光静置，每隔1h用HPLC测定游离虾青素的含量[8-9]。

1.2.2.3 碱浓度对游离虾青素含量的影响 取色素油含量0.1g/mL的粗提液5mL置于具塞试管中，加入新配制的NaOH-乙醇溶液1.0mL，浓度分别为0.014、0.017、0.020、0.023mol/L，混匀，氮气吹扫至总体积5mL，5℃避光静置，每隔1h测定游离虾青素的含量。每个样品平行3次。

1.2.2.4 皂化液中虾青素的稳定性 取色素油含量0.1g/mL的粗提液5mL于具塞试管中，加入0.020mol/L新配制的NaOH-乙醇溶液1.0mL，混匀，氮气吹扫至总体积5mL，于5℃避光静置12h，然后将皂化液分别置于5℃和25℃条件下避光保藏，每隔6h用HPLC测定游离虾青素含量。每个样品平行3次。

1.2.3 虾青素的测定 用高效液相色谱法分析虾青素的含量，色谱条件如下[10]：

色谱柱：Ecosil反相C18柱（4.6mm×250mm）；流动相：包括A和B，其中A为二氯甲烷∶甲醇∶乙腈∶水（5.0∶85.0∶5.5∶4.5），B为二氯甲烷∶甲醇∶乙腈∶水（22.0∶28.0∶45.5∶4.5）；梯度洗脱：0%B洗脱8min，0%～100%的B洗脱24min；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测器：DAD，即二极管阵列检测器；进样量5μL；检测波长476nm（DAD扫描结果）。

1.3 数据处理

数据分析采用SPSS18（Statistical Product and Service Solutions）软件；数据绘图采用Origin8.0软件。

2 结果与分析

2.1 虾青素标准曲线

配制不同浓度的虾青素标准品，用高效液相色谱法分析虾青素含量，并绘制标准曲线，结果如图1所示。

从图1可见虾青素的含量与峰面积成正比，将标准曲线回归方程进行转化，可以得到虾青素含量的方程为：虾青素含量（μg/mL）=0.00812A+0.745，R2= 0.9964，式中A为峰面积（mAU·s）。

图1 虾青素标准曲线Fig.1 The standard curve of astaxanthin

2.2 粗提液浓度对皂化效果的影响

在皂化过程中，利用薄层层析法分析皂化液可以对皂化过程进行直观、方便的跟踪检测。

图2 粗提液皂化前后的薄层色谱图Fig.2 TLC of crude extract before and after saponification

由图2可知，随着皂化反应的进行，Rf为0.43和0.14的总类胡萝卜素斑点变淡甚至消失，说明虾青素酯转化成了游离虾青素。根据薄层色谱图上色带的显示情况，可直观分析不同条件下的皂化过程，确定碱液的浓度范围和皂化所需的时间。

表1 不同粗提液浓度和碱浓度时的皂化时间（h）Table 1 The saponification time at different crude extract and alkali concentration

如表1所示，随着粗提液浓度的增大，24h内完成皂化所需的碱浓度液也逐渐增大。粗提液浓度为0.05、0.10、0.20、0.30g/mL，碱浓度为0.01、0.02、0.03、0.04mol/L时；分别需要10.0、12.0、20.0、15.0h才能使粗提液中的虾青素酯完全转化为游离虾青素。粗提液浓度较低时，在薄层板上的显色不明显，也会增大高效液相色谱分析时的误差，同时不利于后期的分离；粗提液浓度过高，不易完全溶于乙醇溶液，且皂化时需提高碱液浓度和延长时间，容易导致色素的氧化损失。因此，综合考虑选择粗提液浓度为0.1g/mL。

2.3 皂化温度对游离虾青素含量的影响

温度是影响化学反应的重要因素，图3为5、15、25℃条件下皂化时，游离虾青素的含量变化情况。随着温度的升高，皂化反应的起始速度较快，游离虾青素含量达到最高值时所需的时间变短，然而最高含量相对较低。这与陈兴才等[11-12]利用KOH皂化研究结果是类似的，温度越高，皂化速度越快，但是虾青素氧化损失加剧，而他们的研究采用的碱液浓度较高，此而皂化时间较短。由图3可见，5、15、25℃下皂化虾青素的最高含量分别55.75、53.85、50.95μg/mL，而所需的时间分别为12、7、5h。这表明高温虽然能够加快反应速度，同时也会造成虾青素的降解或氧化损失。因此，选择皂化温度为5℃。

图3 皂化温度对游离虾青素含量的影响Fig.3 Effect of saponification temperature on the content of free astaxanthin

2.4 碱浓度对游离虾青素含量的影响

碱液浓度也是影响皂化的主要因素，如图4所示，在皂化反应的起始阶段，碱浓度越高，皂化液中游离虾青素的增速越大。然而碱浓度过高，所得游离虾青素的总量较低，如0.023mol/L时，5h即可完全皂化，游离虾青素含量最大仅为52.85μg/mL，这可能由于碱浓度过高导致虾青素氧化损失加剧；但是碱浓度过低，皂化速度太慢，如0.014mol/L时，12h尚未完成皂化反应；碱浓度0.020mol/L，12h时游离虾青素的含量最高，为55.75μg/mL，12～13h时含量基本不变。因此，选择所添加NaOH-乙醇溶液的浓度为0.020mol/L。

2.5 皂化液中虾青素的稳定性

为探索5℃条件下皂化12h后，皂化液中的游离虾青素含量的稳定性，分别将皂化液放置于5℃和25℃避光静置，分析游离虾青素含量随放置时间的变化。

图4 碱浓度对游离虾青素的含量的影响Fig.4 Effect of alkali concentration on the content of free astaxanthin

图5 放置时间对游离虾青素含量的影响（5、25℃）Fig.5 Effect of storage time on the content of free astaxanthin（5、25℃）

由图5所示，0～12h的虾青素含量为粗提液在5℃条件下的皂化情况。12h之后，为将5℃下皂化液分别置于5℃和25℃下放置游离虾青素含量变化情况。由图5可见随着时间的延长游离虾青素含量逐渐降低，其中25℃条件下游离虾青素含量下降较快，如30h时的含量为50.0μg/mL，低于5℃下的54.1μg/mL。48h时，5℃和25℃下游离虾青素的含量分别为49.8μg/mL和41.6μg/mL。这主要是由于虾青素温度稳定性与在碱性环境下的稳定性有关，这与先前报道的虾青素在较高的温度下、在碱性环境中稳定性较差是一致的[13]。因此皂化完成后应低温保藏或尽快进行后续的分离操作。

2.5 虾青素粗提液皂化前后的成分比较分析

如图6所示为粗色素油含量0.1g/mL的粗提液（总类胡萝卜素含量约72.5μg/mL）在5℃条件下皂化12h前后的情况。图6（a）为粗提液的高效液相色谱图，游离虾青素峰面积（mAU·s）为3572.7，根据虾青素标准曲线方程可得，粗提液中游离虾青素含量为29.76μg/mL。图6（b）为粗提液皂化后的高效液相色谱图，游离虾青素峰面积（mAU·s）为6774.0，根据虾青素标准曲线方程可得，皂化后粗提液中游离虾青素含量为55.75μg/mL。

3 结论

随着皂化温度的升高，皂化初始速度提高，但达到虾青素的最高浓度下降；而随着碱液浓度的提高皂化速度提高，但浓度太高虾青素稳定性下降；皂化完成后色素在皂化体系中稳定性较差。因此，综合各因素得到适宜的皂化条件为：粗提液色素油含量0.1g/mL、皂化温度5℃、NaOH-乙醇浓度0.020mol/L，皂化时间12h，此条件下游离虾青素含量为55.75μg/mL。

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图6 粗提液皂化前（a）后（b）的高效液相色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of crude extract before（a）and after saponification（b）

[2]任艳．南极磷虾蛋白加工利用的初步研究[D]．青岛：中国海洋大学，2009．

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Study on the saponification technique of astaxanthin esters from Antarctic krill shells

JIANG Qi-xing1，SONG Su-mei1，XIA Wen-shui1，LIU Fu-jun2，XU Yan-shun1，LIU Dong-mei2，WANG Hai-ou1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Liaoning Province Dalian Ocean Fishery Group，Dalian 116113，China）

Saponification conditions of astaxanthin esters from Antarctic krill shells were studied，and effects of pigment concentration，saponification temperature and alkali concentration on saponification were determined by taking free astaxanthin as index.Results showed that when the crude extract concentration was 0.1g/mL，the time and alkali concentration required to complete the saponification were appropriate.The time required to complete the saponification was shorter when the temperature and alkali concentration were higher，but the loss was greater.The most suitable saponification conditions were crude extract concentration 0.1g/mL，saponification temperature 5℃，alkali concentration 0.020mol/L and 55.75μg/mL of free astaxanthin was obtained at 12h of saponification.

Antarctic krill shells；astaxanthin ester；saponification；astaxanthin

TS209

B

1002-0306（2014）08-0233-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.044

2013－08－05 *通讯联系人

姜启兴（1977-），男，博士，副教授，研究方向：食品加工与保藏。

“十二五”国家“863”计划项目（2011AA090801）。