茯苓菌种液体深层发酵条件优化

唐业刚，胡霭雯

（武汉生物工程学院，湖北武汉430415）

茯苓菌种液体深层发酵条件优化

唐业刚，胡霭雯

（武汉生物工程学院，湖北武汉430415）

采用茯苓9号菌株，通过单因素实验和正交优化实验对其液体发酵条件进行优化。结果表明，液体发酵最佳培养基为：葡萄糖30g，酵母浸膏与蛋白胨共10g（添加比例4∶5），KH2PO41g，MgSO40.5g，维生素B17.5mg，水1L。在常温、150r/min时，菌种最佳液体发酵条件为：培养基初始pH为5.5、培养天数为8d、装瓶量为70mL/250mL锥形瓶、接种量为7%时，可得到较好菌丝增重量，最大菌丝干重可达5.004g/L。

茯苓，液体发酵，正交优化

茯苓，又名茯菟、不死面、松苓等，属真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，茯苓属[1]，广泛分布于日本、东南亚、北美洲和澳大利亚及我国云南、福建、安徽等10多个省区。茯苓含有多种营养成分[2]，具有诸如调节免疫功能、抗肿瘤、抗衰老、抗炎等药理作用[3-4]，茯苓系列保健品如茯苓酸奶、茯苓酒、茯苓果茶等，及茯苓多糖粉、茯苓多糖口服液、桂枝茯苓胶囊等也正在被迅速开发。茯苓传统固体栽培生产周期长、产量低、受气候和产地限制，已越来越难以满足其巨大的市场需求，而液体深层发酵技术则可较好解决上述问题。

目前国内对茯苓液体发酵产物药用成分，如茯苓多糖等的提取、纯化、检测，及其药理学作用的研究报道[5-10]较多，但对茯苓液体发酵条件，特别是发酵培养基成分正交优化的实验报道则不多见。文献报道多集中于茯苓菌种液体发酵培养条件[5，7，11-12]，如针对温度、转速、接种量等进行的单因子实验研究，对茯苓液体发酵培养基的研究，也大多集中于简单的碳源、氮源种类及浓度筛选的单因子实验[5，11，13-14]，对培养基中有机物维生素、无机盐浓度等成分的报道不多，对于培养基中各成分对发酵效果影响的互作，则罕有文献[15]报道。本文采用单因子实验初筛结合正交实验进一步考查互作的实验方法，从碳源、氮源、无机盐及有机物维生素B1等四个方面，对茯苓9号菌种液体发酵培养基成分进行了优化研究，并对发酵培养的起始pH、装液量、接种量及发酵终点进行了初探，以期为茯苓菌种的大规模液体工厂发酵生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试茯苓9号试管母种菌种 购自华中农业大学大学菌种保藏中心；琼脂粉 天津科密欧化学试剂开发中心；牛肉浸膏 天津英博生化试剂有限公司；酵母浸粉、蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司；维生素B1中国惠兴生化试剂有限公司（上海）。

SW-CJ-1F型单人双面净化工作台 苏州净化；DHP-9052型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；202-0B型干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；P270A型普通摇床 武汉中科科仪技术发展有限责任公司；手提式高压灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；PHS-25C型数显酸度计 上海宇隆仪器有限公司；电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 母种扩繁 扩繁培养基成分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、维生素B110mg、水1.0L，pH自然。将所购试管母种按1∶20比例转管接种，培养箱中25℃暗培养至菌丝长满试管，备用。

1.2.2 一级摇瓶种子制备 一级摇瓶配方：葡萄糖20g、酵母浸粉4.0g、蛋白胨5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g、维生素B110mg、水1.0L，pH自然，以100mL/250mL锥形瓶装液量分装，121℃30min灭菌。

接取1.2.1所得扩繁菌丝约2cm长度，并将其分割成多段，接入上述培养基，25℃暗培养，先静置24h，再于摇床上以150r/min常温发酵一周，至形成大量均匀致密菌丝球，作为液体摇瓶培养的种子备用。

1.2.3 茯苓液体摇瓶发酵培养基成分的优化

1.2.3.1 碳、氮源种类的筛选 碳源筛选培养基：选择葡萄糖和蔗糖两种生产中常见的廉价碳源种类进行实验，并考查二者的协同作用。分别选取葡萄糖20g、蔗糖20g、葡萄糖10g+蔗糖10g为碳源，培养基其他成分为：酵母浸粉4.0g、蛋白胨5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g、维生素B110mg、水1.0L，pH自然。

氮源筛选培养基：氮源在液体发酵中起着提供主要营养的重要作用，本实验对氮源种类进行考查。分别选取蛋白胨9g、酵母浸粉9g、牛肉浸膏9g、尿素9g、蛋白胨5g+酵母浸粉4g为氮源，考查五种氮源种类对发酵效果的影响，培养基其他成分为：葡萄糖20g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g、维生素B110mg、水1.0L，pH自然。

上述实验均以100mL/250mL锥形瓶装液量分装、121℃30min灭菌，均按10%（mL/mL）接种量接种1.2.2所得一级摇瓶液体种子，于摇床上150r/min常温摇瓶发酵7d，发酵结束后，纱布过滤发酵物，所得菌丝球50℃烘干至恒重，称重，计算菌丝球干重（g/L）。

1.2.3.2 碳源、氮源、无机盐、维生素B1浓度的单因子实验 a.碳源浓度的单因子实验：选用1.2.3.1中的最佳碳源种类，设置10、20、30、40、50g五个梯度，培养基其他成分为蛋白胨+酵母浸粉9g（蛋白胨/酵母浸膏＝5/4）、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、维生素B110mg，水1.0L。

b.氮源浓度的单因子实验：基于1.2.3.1中的最佳氮源蛋白胨+酵母浸膏（5∶4），设置6、7、8、9、10g五个梯度，培养基其他成分为葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、维生素B110mg，水1.0L。

c.KH2PO4/MgSO4浓度（比例固定为2∶1（g/L））单因子实验：据王伟霞[13]报道，矿物质浓度是茯苓液体发酵的重要影响因素，本实验对此进行考查，设置2.5/1.25、2.0/1.0、1.5/0.75、1.0/0.5、0.5/0.25五个处理，培养基的其他成分为葡萄糖20g、蛋白胨+酵母浸粉9g（蛋白胨/酵母浸膏＝5/4）、维生素B110mg，水1.0L。

d.维生素B1的单因子实验（mg/L）：目前少见茯苓液体发酵培养基中VB1添加浓度的报道，本实验对此进行考查，设置2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mg/L五个梯度，培养基其他成分为：葡萄糖20g、蛋白胨+酵母浸粉9g（蛋白胨/酵母浸膏＝5/4）、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、水1.0L。

以上实验的发酵条件均为50mL/250mL锥形瓶装液量、10%一级摇瓶种子接种量、培养基pH自然，摇床转速150r/min，常温，发酵时间为7d。发酵结束后均按1.2.3.1中方法测量菌丝球平均干重并记录数据。

1.2.3.3 茯苓液体发酵培养基成分的正交优化实验

根据1.2.3.2各单因子实验的结果，分别选用液体发酵后菌丝体干重最大的3个水平，进行正交实验（L9（34））设计（见表1），进行培养基成分的优化实验。发酵条件同1.2.3.2。

表1 正交实验的因素与水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test design

1.2.4 茯苓液体菌种培养条件优化 以下实验液体摇瓶培养基成分均采用1.2.3.3中正交优化后的结果。

1.2.4.1 起始pH单因子实验 将正交优化培养基的起始pH分别调成4.5、5.0、5.5、6.0、6.5五个水平，在装液量为100mL/250mL锥形瓶、一级摇瓶种子接种量为10%的条件下，以150r/min在常温进行摇瓶发酵7d，发酵结束后，称量菌丝体干重，分析数据，得出培养基的最佳起始pH。

1.2.4.2 茯苓摇瓶时间单因子实验 正交优化培养基在装液量为100mL/250mL锥形瓶、接种量为10%、pH自然的条件下，以150r/min在常温摇瓶发酵，分别在发酵后第4、5、6、7、8、9、10d后结束发酵，称量菌丝体干重，分析数据，得出最佳摇瓶培养时间。

1.2.4.3 接种装液量单因子实验 分别设置40、50、60、70、80、90、100mL/250mL锥形瓶等7种不同水平装液量配制正交优化培养基，在接种量为10%、pH自然的条件下，以150r/min在常温摇瓶发酵7d，观察菌丝生长状态，并称量菌丝体干重后分析数据，得出最佳接种装瓶量。

1.2.4.4 接种量单因子实验 分别设置4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%等七种不同接种量，将1.2.2所得一级摇瓶种子接种到正交优化培养基中，在装液量为100mL/250mL锥形瓶、正交优化培养基pH自然的条件下，以150r/min在常温摇瓶发酵7d，观察菌丝生长状态，并称量菌丝体干重后分析数据，得出最佳接种量。

1.2.4.5 最佳培养条件验证实验 选取上述单因子试验中的最佳起始pH、最佳摇瓶发酵时间、最佳装瓶量及最佳接种量作为培养条件，进行发酵条件验证试验，发酵结束后称量菌丝球干重，分析数据，得出最佳发酵条件。

1.2.5 数据分析方法 采用邓肯氏新复极差法（Duncan’s Multiple Range Test）评估每个因素下各水平实验处理间的差异显著性（p=0.05）。

2 结果与分析

2.1 茯苓液体菌种发酵培养基成分的优化结果

2.1.1 不同碳源种类对茯苓液体发酵的影响 实验结果见表2。由表2可知，葡萄糖对茯苓液体发酵菌丝生长的促进效果最佳，菌丝球平均干重极显著高于另两种碳源，这与李羿[11]、薛正莲[5]、付玲等[14]的报道结果相似，这表明，茯苓菌种在液体发酵培养时更容易吸收利用葡萄糖这样的小分子单糖。还可看出，蔗糖+葡萄糖作为碳源时，其平均菌丝球干重最低，极显著低于另两组。这表明，葡萄糖和蔗糖混合使用时两者可能存在着一定的相互拮抗作用，其具体原因有待进一步研究。

表2 不同碳源对茯苓液体发酵的影响Table 2 Effect of different carbon sources in liquid fermentation of poria

2.1.2 不同氮源种类对茯苓液体发酵的影响结果实验结果见表3，由表3可知，尿素组平均菌丝球干重仅为0.165g/L，极显著低于其他组，这表明，茯苓9号菌株液体发酵对无机氮源的利用效率较差，因在摇瓶过程中，有明显的尿素晶体状物质析出，故菌丝生长差也有可能是因为尿素浓度添加过高，具体原因有待进一步研究。实验结果表明，蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨+酵母浸粉对茯苓液体菌种生长都有明显促进作用，其中，蛋白胨+酵母浸粉组合极显著高于其他氮源种类。这提示着茯苓9号菌株对动物性氮源（蛋白胨）和微生物源性氮源（酵母浸粉）搭配时的氮源利用效果最佳，极显著高于二者的单独利用效率，至于具体的搭配比例是否以5∶4为最佳比例，则有待于进一步深入研究。

2.1.3 碳源、氮源、矿质盐、维生素B1浓度筛选结果

2.1.3.1 不同碳源浓度对茯苓液体发酵的影响结果实验结果见表4，由表4可知，随着葡萄糖浓度的增加，菌丝球干重也大幅度增加，当葡萄糖达到30g/L时，菌丝球干重最大，随后菌丝球干重开始减少，但减少缓慢。多数学者[5-7]研究认为，以葡萄糖为碳源时，其浓度过高或过低均不利于液体发酵时茯苓菌丝的生长，本实验结果表明，葡萄糖浓度在30g/L时菌丝球干重达到最大，当葡萄糖浓度大于30g/L时，菌丝球干重逐渐减小，但是变化较为缓慢，这与李羿等[11]的报道结果相似。

2.1.3.2 不同氮源浓度对茯苓液体发酵的影响结果

实验结果见表5。由表5可知，随着蛋白胨+酵母浸粉浓度的增加，菌丝球干重也大幅度增加，当蛋白胨+酵母浸粉达到8g/L时，菌丝球干重最大，随后菌丝球干重开始减少。据李羿等[11]报道，如果茯苓液体发酵时氮源浓度过低，会导致营养不足，明显不利于菌体生长；但如果氮源浓度过大，则易造成菌体早衰。本实验亦取得类似结果，当氮源浓度为8g/L时，茯苓液体发酵效果最好，浓度过高或过低均对液体发酵效果有不利影响。

表5 不同氮源浓度对茯苓液体发酵的影响Table 5 Effect of different nitrogen source concentration on liquid fermentation of poria

表7 不同维生素B1浓度对茯苓液体发酵的影响Table 7 Effect of different VB1concentration on liquid fermentation of poria

表3 不同氮源对茯苓液体发酵的影响Table 3 Effect of different nitrogen sources on liquid fermentation of poria

表4 不同碳源浓度对茯苓液体发酵的影响Table 4 Effect of different carbon source concentration on liquid fermentation of poria

表6 不同矿物质浓度对茯苓液体发酵的影响Table 6 Effect of different mineral concentration on liquid fermentation of poria

2.1.3.3 不同矿物质浓度对茯苓液体发酵的影响结果 实验结果见表6，由表6可知，随着KH2PO4+MgSO4浓度的增加，菌丝球干重也大幅度增加，当KH2PO4达到1.5g/L、MgSO4达到0.75g/L时，菌丝球干重最大，随后菌丝球干重开始减少。其原因可能是此矿物质浓度搭配时，能为茯苓菌种液体发酵提供最适渗透压环境，故菌丝生长最好。

2.1.3.4 不同维生素B1浓度对茯苓液体发酵的影响结果 实验结果见表7，由表7可知，随着维生素B1浓度的增加，菌丝球干重也大幅度增加，当维生素B1达到7.5mg时，菌丝球干重最大，随后菌丝球干重开始减少。目前少有维生素B1对茯苓液体发酵培养效果的单因子实验报道，甚至有的学者[16]研究的培养基中不添加维生素B1，这可能与茯苓液体发酵培养基培养基中维生素B1所需量的多少与茯苓菌种有着较大关系有关。

表8 茯苓液体发酵培养基成分的L9（34）正交优化实验结果Table 8 L9（34）orthogonal test results of poria fermentation medium composition

2.1.4 正交优化实验结果及分析 由表8可知，6号培养基为最优培养基，具有生长优势，其菌丝球干重最大。由极差R可以看出：优先级是D＞A＞C＞B，即维生素B1＞葡萄糖＞KH2PO4/MgSO4＞蛋白胨+酵母浸粉。由k值可知，最佳组合为A2B3C1D2，即实验组6号培养基配方，正交分析结果与实验结果相同，由此确定，6号培养基为最终正交优化结果。

2.2 茯苓液体菌种发酵条件优化的结果

2.2.1 茯苓液体发酵培养基不同起始pH对发酵效果的影响结果 实验结果见表9，由表9可知，茯苓喜欢偏酸性的发酵环境，当pH为5.5时，茯苓液体发酵生长状况最佳，菌丝球干重最大可达2.849g/L，实验结果符合茯苓确属喜酸性食用菌菌种的生物学特征。

2.2.2 不同培养时间对茯苓液体发酵的影响结果 实验结果见表10，由表10可知，随着发酵时间的增加，茯苓菌丝球干重逐步递增，当发酵培养时间为8d时，菌丝球干重最大，可达2.228g/L，随后开始减少。这个结果与很多文献[11，13，16]报道的最佳发酵时间为5～6d有所出入，其原因可能是本文采用的是100mL的装液量，较文献中所述的50mL生长要缓慢，故所需培养时间相对要长一些有关。

表9 培养基不同起始pH对茯苓液体发酵的影响Table 9 Effect of initial pH value of medium on liquid fermentation of Poria

2.2.3 不同装液量对茯苓液体发酵的影响结果 实验结果见表11，由表11可知，当装瓶量为70mL时，茯苓生长状况最佳，菌丝球干重最大可达3.906g/L。这与大部分文献[6，12，16]报道的最佳装液量为60mL/250mL稍有差异，其原因可能与本实验所采用的接种量为10%，而文献中一般为5%的接种量有关。

表10 不同发酵培养时间对茯苓液体发酵的影响Table 10 Effect of different fermentation culture time on liquid fermentation of poria

表11 不同装液量对茯苓液体发酵的影响Table 11 Effect of the different volume of the liquid on liquid fermentation of poria

2.2.4 不同接种量对茯苓液体发酵的影响结果 实验结果见表12，由表12可知，接种量为7%时，茯苓菌种液体发酵生长状况最佳，菌丝球干重最大可达4.786g/L。这与大部分文献[11-12，16]报道的最佳接种量为6%略有差异，其原因可能与本实验所采用的装液量为100mL/mL，而文献中一般为50mL/mL的装液量有关。2.2.5 最佳培养条件验证实验结果 当综合采用2.2.1～2.2.4各单因子实验的最佳培养条件，即摇瓶培养基起始pH为5.5、装瓶量为70mL/250mL、接种量为7%，发酵培养时间为8d时，所得菌丝球平均干重为（5.004±0.241）g/L，五个重复数据中除了一个数据略低于2.1.1～2.2.4各试验结果的最高值4.786g/L外，其余数据均高于此值，这显示上述验证实验的培养条件即为最佳培养条件。至于上述验证实验的四个培养条件对摇瓶发酵结果的互作研究，则有待于进一步正交试验设计进行深入研究。

Optimization of poria liquid fermentation condition

TANG Ye-gang，HU Ai-wen
（Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，China）

Liquid fermentation optimal condition of poria No.9 was studied in this paper by designing single factor experiments and optimization of orthogonal experiment.The results showed that the optimum fermentation medium includes glucose 30g，yeast extract and peptone 10g（the ratio was 4∶5），KH2PO41g，MgSO40.5g，VB17.5mg in the water of 1L.The optimum cultivation conditions in the temperature of 25℃，rotation speed 150r/min were as follow：rinitial pH5.5，cultivation time 8d，liquid strain quantity of inoculation 7%，70mL medium/250mL erlenraeyer，and the maximum mycelial dry weight could reach 5.004g/L.

poria；liquid fermentation；orthogonal designing

TS201.7

A

1002-0306（2014）08-0214-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.040

2013－08－19

唐业刚（1979-），男，硕士研究生，讲师，研究方向：食用菌液体发酵及金属富集。