酶法提高芋头浆中淀粉水解率的工艺条件研究

姜绍通，郑 娟，殷嘉忆

（合肥工业大学农产品加工研究院，合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽合肥230009）

酶法提高芋头浆中淀粉水解率的工艺条件研究

姜绍通，郑 娟，殷嘉忆

（合肥工业大学农产品加工研究院，合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽合肥230009）

针对芋头浆中被粘多糖蛋白质和果胶等粘性物质包裹的淀粉难以水解的难题，研究采用复合纤维素酶-果胶酶和中性蛋白酶分步酶解法对芋头浆进行前处理，以提高α-淀粉酶酶解芋头浆淀粉的水解率。通过单因素实验和正交实验优化，结果表明，复合纤维素酶-果胶酶酶解最佳条件为：添加量0.2%，酶配比1∶1，pH5.8，酶解时间40min；中性蛋白酶酶解最佳条件为：添加量0.8%，pH7.3，酶解温度48℃，作用时间7.0h，该条件下，芋头浆出汁率和蛋白质水解率分别达到74.67%和40.46%。对经上述酶法预处理后的芋头浆中的淀粉进行酶水解，其水解率高达87.39%，与芋头原浆直接酶解相比提高了33.07%。

芋头，淀粉，分步酶解，正交实验

芋头营养价值丰富，具有低脂肪、高缮食纤维和高淀粉的特点，蛋白质氨基酸种类齐全[1]，必需氨基酸与氨基酸总量的比例接近于酪蛋白，且含有谷物所缺少的色氨酸[2]。此外，芋头还含有丰富的胡萝卜素、类黄酮、甾醇和较多的维生素B1、B2、C、D2和E[3]。芋头不仅可以食用，还可以药用。中医认为芋头具有宽肠胃、补脾胃、破血散结、治疗食少病弱的功效[4]，还有降脂、降血压、防治冠心病和延缓衰老的作用[5]。

目前，市场上的芋头深加工产品不多，主要有芋头全粉、芋头冰激凌、芋头糊等固体或半固体类产品[6-8]，液体饮料类产品开发鲜有报道，这主要因为芋头中淀粉含量较高，容易产生沉淀[9]，难以形成均一稳定体系。如果将芋头淀粉水解成小分子糖类物质再调制饮料，则有利于改善芋头饮料的稳定性。

由于芋头淀粉颗粒十分细小（直径一般为5μm以下），且芋头中含有大量的粘质如粘蛋白、粘多糖、果胶等，淀粉颗粒被包裹其中，酶解很困难[10-11]。果胶酶和纤维素酶的协同作用，能有效催化果胶和纤维素分解，降低粘度，暴露出被蛋白质包裹的淀粉颗粒，打破果汁分散体系的电荷平衡，加速芋头浆过滤，提高芋头清汁产率[12-15]。中性蛋白酶是以一种内切酶，能将大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，其作用条件温和，水解效率高，风味佳，保持芋头浆风味的同时能够有效的破坏蛋白质网状结构，促进淀粉颗粒的溶出。本研究以芋头为原料，综合运用果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶，拟达到充分破坏细胞结构以及淀粉与母体结合的目的，预期为淀粉酶解创造有利条件，并为芋头饮料制备提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜莱阳芋头 采购于家乐福超市；高温α-淀粉酶 酶活力60000U/mL，购于诺维信有限责任公司；纤维素酶（酶活力10000U/g）、果胶酶（酶活力30000U/g）、中性蛋白酶（酶活力200000U/g） 购于南宁庞博生物工程有限公司；盐酸、氢氧化钠、甲醛（分析纯）、柠檬酸（食品级）、柠檬酸钠（食品级） 均购于国药集团化学试剂有限公司。

JYL-D02料理机 九阳有限公司；WZZ-2B可见光分光光度计 上海柯登精密仪器有限公司；UDK152自动凯式定氮仪 意大利VELP公司；SER148自动脂肪测定仪 意大利VELP公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芋头分步酶解工艺流程：

1.2.2 实验步骤

1.2.2.1 芋头浆的制备 鲜芋头清洗煮熟后去皮，按料水比1∶2（W/W）加水打浆备用。

1.2.2.2 复合纤维素酶-果胶酶酶解工艺的优化 以出汁率为指标，对酶配比（m纤维素酶∶m果胶酶为1∶3～3∶1）、酶添加量（芋头浆体积的0.09%～0.21%）、pH（4.0～6.0）、酶解时间（30～150min）进行单因素实验考察，确定主要影响因素及水平区间，在合适水平区间内选用L9（34）正交表进行正交实验设计，正交实验设计因素水平见表1，通过正交分析确定最佳酶解条件，并进行验证，每组实验重复三次，取平均值。根据纤维素酶、果胶酶的性质及前期实验，发现复合纤维素酶-果胶酶在50～60℃范围内对出汁率影响不显著，故在单因素及正交实验中反应温度取为50℃。芋浆在最佳条件下酶解备用。

表1 复合纤维素酶-果胶酶正交因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design of compound cellulose-pectinase

1.2.2.3 中性蛋白酶酶解条件的优化 将1.2.2.2得到的芋头浆，添加中性蛋白酶继续酶解。以芋头蛋白水解度为指标，对加酶量（芋头浆体积的0.2%～1.0%）、pH（6.5～8.5）、酶解时间（2.5～6.5h）、酶解温度（35～ 55℃）进行单因素实验考察，确定主要因素及水平区间，在合适水平区间内选用L9（34）正交表进行正交实验设计，正交实验设计因素水平见表2，通过正交分析确定最佳酶解条件，并进行验证，每组实验重复三次，取平均值。1.2.2.2得到的芋浆在最优条件下继续酶解备用。正交实验设计因素及水平见表2。

表2 中性蛋白酶正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design of neutral protease

1.2.2.4 分步酶法预处理对芋头淀粉水解度的影响

分别将A、B、C、D四种芋头浆（A：原芋头浆；B：复合纤维素酶-果胶酶处理过的芋头浆；C：中性蛋白酶处理过的芋头浆；D：复合纤维素酶-果胶酶和中性蛋白酶共同处理过的芋头浆）在相同条件（高温ɑ-淀粉酶添加量8.4U/mL，pH6.8，反应温度85℃，反应时间100min）下酶解，比较芋头淀粉的水解度。每组实验重复三次，取平均值。

1.2.3 测定指标与方法

1.2.3.1 出汁率的测定 鲜芋头清洗煮熟后去皮，按料水比1∶2（W/W）加水打浆，酶解后，取50mL样品，放入离心管中，4500r/min离心10min，取出测量上清液质量。

出汁率（%）=（上清液质量（g）-打浆时加入水的质量（g））/打浆所用芋头质量（g）×100

1.2.3.2 蛋白质水解度的测定[16]分别采用中性甲醛滴定法[17]和凯氏定氮法[18]测定游离氨基态氮含量和原料总氮含量，按照下式计算蛋白质水解度：

蛋白质水解度（%）=水解液中游离氨基态氮含量（%）/原料中总氮含量（%）×100

1.2.3.3 还原糖的测定 DNS比色法[19]。

1.2.3.4 淀粉水解率的测定 淀粉含量的测定：酸水解法[19]；按照下式计算淀粉水解率：

淀粉水解率（%）=（酶解前淀粉量（g/100g）-酶解后淀粉量（g/100g））/酶解前淀粉量（g/100g）×100

2 结果与分析

2.1 复合果胶酶-纤维素酶酶解工艺的优化

2.1.1 单因素结果分析

2.1.1.1 酶配比对出汁率的影响 在反应温度50℃，反应时间40min，pH4.5，酶添加量为芋头浆体积的0.15%的条件下，考察不同酶配比进行单因素考察，结果见图1。

由图1结果可知，在酶添加总量一定的条件下，随着纤维素酶比例的增加，出汁率逐渐上升，当酶配比达到1∶1时，出汁率达到最大值64.00%，当出汁率达到最大值以后，出汁率随纤维素酶的增加而有所降低。这可能由于果胶在芋头浆中并不单独存在，而是与纤维素相互缠绕，互为依托，只有纤维素被分解后，被纤维素夹裹的果胶才能充分与果胶酶作用[20]，浆液粘度降低，出汁率升高，但是当纤维素酶继续增加时，由于酶总量一定，果胶酶的量减少，底物得不到充分酶解，出汁率降低。在m纤维素酶∶m果胶在1∶1.5～1∶0.7之间出汁率相对较高，其中酶配比1∶1时出汁率最大。

图1 酶配比对出汁率的影响Fig.1 Effect of ratio of enzyme on juice yield

2.1.1.2 酶添加量对出汁率的影响 在反应温度50℃，反应时间40min，pH4.5，m纤维素酶与m果胶酶比例为1∶1的条件下，考察不同酶添加量对出汁率的影响，结果见图2。

图2 酶添加量对出汁率的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on juice yield

由图2可知，随着酶用量的增加，芋头出汁率逐渐增大，酶添加量达到0.18%后，随着酶添加量的增加，出汁率增幅较小，基本趋于稳定。这是因为在一定底物浓度下，酶解速度与酶浓度成正比关系，当酶浓度达到一定程度时，酶浓度与底物表面几乎达到饱和。从节约酶的角度考虑，添加量在0.16%～0.20%范围内，即可达到理想的出汁效果。

2.1.1.3 pH对出汁率的影响 在反应温度50℃，反应时间40min，m纤维素酶与m果胶酶比例为1∶1，酶添加量为芋头浆体积的0.15%的条件下，考察不同pH对出汁率的影响，结果见图3。

由图3可以看出，出汁率随着pH升高而增加，当pH为4.5时出汁率增长缓慢，pH5.5时出汁率达到最高，然后开始降低。这主要由于酶作为一种特殊的蛋白质分子，pH会影响酶的活性和酶促反应速度，在接近酶的最适pH时酶活性最高，过高或过低均对酶促反应不利，pH在5.2～5.8范围内出汁率相对较高，其中，pH5.5时出汁率最高，达到67.60%。

图3 pH对出汁率的影响Fig.3 Effect of pH on juice yield

2.1.1.4 反应时间对出汁率的影响 在反应温度50℃，m纤维素酶与m果胶酶比例为1∶1，酶添加量为芋头浆体积的0.15%，pH5.5条件下，考察不同反应时间对出汁率的影响，结果见图4。

图4 反应时间对出汁率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on juice yield

从图4可知，随着反应时间的延长，出汁率逐渐增加，反应时间从30～60min，出汁率升高显著，且上升趋势显著；而当时间继续增加时，出汁率趋于平缓。这主要因为底物浓度随着酶反应时间的延长而显著降低，酶解作用基本完成。在40～80min区间内，出汁率相对较高，其中，60min时出汁率达到66.62%。

2.1.2 正交结果分析 通过单因素方差分析，酶配比、加酶量、pH和反应时间均高度显著（p＜0.01），选用L9（34）正交表对四个因素进行正交实验设计，以优选出最佳酶解条件。根据上述的单因素实验确定各个因素的对岀汁率的影响，正交实验结果、方差分析表见表3、表4。

由表4数据分析可知，由R值大小确定主次顺序依次为：D＞A＞C＞B，对于出汁率其含量越高越好，最优组合为：A2B3C3D1。其中，酶配比、pH、反应时间三个因素高度显著，酶添加量显著。

直接分析显示第5组A2B2C3D1为最优组，方差分析A2B3C3D1为最优组，将以上两组作为验证组进行验证实验。实验结果如表5所示。

由验证实验可知，组合A2B3C3D1验证结果优于A2B2C3D1，所以最优条件组合为A2B3C3D1，即果胶酶与纤维素酶的配比为1∶1，复合酶添加量0.2%，pH5.8，反应时间40min。出汁率提高的原因可能是酶促水解和非酶的静电絮凝两部分作用，当芋头浆中的果胶在纤维素酶和果胶酶作用下部分水解后，原来被包裹在内部的带正电荷的蛋白质颗粒就暴露出来，与其他带负电荷的粒子相撞，导致絮凝的发生[22]，从而使出汁率得以提高。

表3 复合纤维素酶-果胶酶正交实验结果Table 3 The orthogonal array design layout and experimental results of compound cellulose-pectinase

表4 复合纤维素酶-果胶酶方差分析表Table 4 The variance analysis of compound cellulose-pectinase

表5 复合纤维素酶-果胶酶验证实验方案与结果Table 5 The plan and results of verification test of compound cellulose-pectinase

2.2 中性蛋白酶酶解工艺的优化

2.2.1 单因素结果分析

2.2.1.1 酶添加量对芋头蛋白水解度的影响 在pH7.0，作用温度50℃，作用时间40min条件下，考察不同酶添加量对芋头蛋白水解度的影响，结果见图5。

由图5看出，随着酶添加量的增加，芋头蛋白水解度逐渐升高，而当酶浓度与底物表面达到饱和时，即使再增加酶添加量，芋头蛋白的水解度也无法提高，加酶量超过0.6%以后，水解度增长幅度缓慢，酶用量超过0.8%后水解度趋于稳定。综合经济效益，酶添加量在0.7%～0.9%区间内，即可达到理想的效果。

2.2.1.2 pH对芋头蛋白水解度的影响 在作用温度50℃，作用时间40min，加酶量为芋头浆体积的0.8%的条件下，考察不同pH对芋头蛋白水解度的影响，结果见图6。

图5 酶添加量对芋头蛋白水解度的影响Fig.5 Effect of proteases dosage on taro protein hydrolysis

图6 pH对芋头蛋白水解度的影响Fig.6 Effect of pH on taro protein hydrolysis

从图6可以看出，随着pH的增加，芋头蛋白的水解度增加，当pH7.0时，蛋白质水解度最大，而后随着pH的增加，芋头蛋白水解度逐渐降低。这可能由于环境pH能够影响酶的活性中心的构象及底物分子的解离状态，在接近酶的最适pH时对酶促反应有利，偏高或者偏低时酶活力中心可解离程度以及酶与底物的结合程度会降低，对酶促反应产生不利影响，从而影响了酶促反应的速度。pH在6.7～7.3范围内芋头蛋白水解度相对较高，其中pH7.0时最大，达13.75%。

2.2.1.3 反应时间对芋头蛋白水解度的影响 在作用温度50℃，加酶量为芋头浆体积的0.8%，pH7.0的条件下，考察不同反应时间对芋头蛋白水解度的影响，结果见图7。

图7 反应时间对芋头蛋白水解度的影响Fig.7 Effect of enzymolysis time on taro protein hydrolysis

由图7可知，反应时间在6.5h之前，芋头蛋白水解度随着反应时间的延长而增加，反应时间达到6.5h之后，蛋白水解度趋于平稳，可能由于随着时间的延长，芋头蛋白基本被完全酶解，所以酶解时间再延长，芋头蛋白的水解度也不会增加，反应时间在6.0～7.0h区间内，芋头蛋白的水解度相对较高，综合经济效益，取反应时间为6.5h，此时芋头的蛋白水解率达到31.95%。

2.2.1.4 酶解温度对芋头蛋白水解度的影响 在加酶量为芋头浆体积的0.8%，pH7.0，反应时间6.5h的条件下，考察不同酶解温度对蛋白质水解度的影响，结果见图8。

图8 反应温度对芋头蛋白质水解率的影响Fig.8 Effect of temperature on taro protein hydrolysis

由图8可以看出，温度从35～45℃，蛋白质水解率呈上升趋势，而当温度继续上升时，蛋白质水解率逐渐下降。这可能因为酶反应速度在接近最适温度时反应最快，在低于最适温度时，反应速度随温度升高而增加，而当温度高于最适温度时，酶的活性中心被破坏，部分酶开始变性失活[21]，降低了酶反应速度。酶解温度在42～48℃区间内，芋头蛋白的水解度相对较高，酶解温度45℃时芋头的蛋白水解率最高，达到31.95%。

2.2.2 正交结果分析 通过单因素方差分析，pH、加酶量、反应时间和反应温度均高度显著（p＜0.01），选用L9（34）正交表对四个因素进行正交实验设计，以优选出最佳酶解条件。据上述的单因素实验确定各个因素的对蛋白水解率的影响，正交实验结果、方差分析表见表6、表7。

由表7数据分析可知，由R值大小确定主次顺序依次为：A＞B＞C＞D，对于蛋白水解度，其值越高越好，选择最优组合为：A3B2C3D3。其中，pH、酶添加量、反应时间和酶解温度均高度显著。

直接分析显示第5组A2B2C3D1为最优组，方差分析A3B2C3D3为最优组，将以上两组作为验证组进行验证实验。实验结果如表8所示。

由验证实验可知，组合A3B2C3D3验证结果优于A2B2C3D1，所以最优条件组合为A3B2C3D3，即pH7.3，酶添加量0.8%，反应时间7.0h，酶解温度48℃。

2.3 分步酶法预处理对芋头淀粉水解率的影响

分步酶法预处理前后的芋头浆，在相同条件下经高温α-淀粉酶酶解后，水解液中还原糖的含量及淀粉水解率见表9。

表6 中性蛋白酶正交实验结果Table 6 The orthogonal array design layout and experimental results of neutral protease

表7 中性蛋白酶方差分析表Table 7 The variance analysis of neutral protease

表8 中性蛋白酶验证实验方案与结果Table 8 The plan and results of verification test of neutral protease

表9 芋头淀粉酶解效果对比表Table 9 The comparison of taro starch enzymolysis result

由表9可以看出，复合纤维素酶-果胶酶和中性蛋白酶共同处理过的芋头浆水解液中还原糖含量最高，淀粉水解率最大，仅由复合纤维素酶-果胶酶或中性蛋白酶处理的水解液中还原糖含量及淀粉水解率较原芋头浆也有所提高。这可能是由于复合纤维素酶-果胶酶分解了果胶和纤维素，降低了芋头浆粘度，暴露出蛋白质包裹的淀粉颗粒，中性蛋白酶破坏了淀粉外面包裹的蛋白质网状结构，淀粉承受的束缚力变小[22]，有利于淀粉颗粒的溶出，增大了底物与酶的作用面积，淀粉被充分酶解，从而提高了水解液中的还原糖含量及淀粉的水解率。

3 结论

采用复合纤维素酶-果胶酶和中性蛋白酶分步处理芋头浆，可以有效提高淀粉水解率。

复合纤维素酶-果胶酶和中性蛋白酶分步处理芋头浆的最佳工艺条件为：果胶酶与纤维素酶的配比为1∶1，复合酶添加量0.2%，pH5.8，反应时间40min，该条件下芋头浆的出汁率为74.67%；中性蛋白酶pH7.3，酶添加量0.8%，反应时间7.0h，酶解温度48℃，芋头蛋白质水解率达到40.46%。经分步处理后的芋头浆中芋头淀粉的水解率达到87.39%，比原芋头浆的提高了33.07%，达到了很好的预期效果。制得的芋汁质地细腻，气味清香，可以采用此为原料加工芋头调配型或者发酵型饮料，很好地解决了芋头饮料因淀粉引起的稳定性问题，对芋头饮料的规模化生产提供了一定的理论依据。

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Study on technological conditions for improving enzymatic hydrolysis rate of taro starch in taro slurry by enzymatic hydrolysis method

JIANG Shao-tong，ZHENG Juan，YIN Jia-yi
（Institute of Food Science and Engineering，Key Laboratory for Agriculture Processing Product of Anhui Province，School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

Taro starch was packed by viscous material such as mucopolysaccharide protein and pectin，resulting in the difficulty of starch hydrolysis in taro slurry.With the aim to solve the difficulty，this study developed a pretreatment method by stepwise enzymatic hydrolysis with compound cellulase-pectinase followed by neutral protease to improve enzymatic hydrolysis rate of taro starch with thermo-stable α-amylase.The optimal conditions for taro starch pretreatment process were determined by single factor and orthogonal experiment as follows：compound cellulose-pectinase 0.2%，the ratio of enzyme 1∶1，pH5.8，and enzymolysis time 40min，neutral proteinase 0.8%，pH7.3，temperature 48℃ for a hydrolysis duration of 7.0h.In this condition，the juice yield and protein hydrolysis rate reached 74.67%and 40.46%respectively.The enzymatic hydrolysis rate of starch in the taro slurry preprocessed by the above method was 87.39%.And the rate of hydrolysis was 33.07%higher than that of taro slurry not pretreated.

taro；starch；stepwise enzymatic hydrolysis；orthogonal experiment

TS215

A

1002-0306（2014）08-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.030

2013－08－13

姜绍通（1954-），男，大学本科，教授，研究方向：农产品加工。

安徽省科技专项资金项目（13Z03042）。