蛹虫草子实体多糖对腹水型肝癌移植瘤超微结构的影响

郭丽新，冯 哲，齐 彦，魏博洋，王世龙，赵 敏

（1.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040；3.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010）

蛹虫草子实体多糖对腹水型肝癌移植瘤超微结构的影响

郭丽新1，2，冯 哲3，齐 彦2，魏博洋2，王世龙2，赵 敏1，*

（1.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040；3.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010）

目的：研究蛹虫草多糖（CMPS）对小鼠移植型腹水型肝癌（H22）体内诱导肿瘤细胞凋亡作用，探讨其抑瘤作用机制。方法：建立H22移植瘤小鼠模型，采用电镜技术观察H22荷瘤小鼠肿瘤组织的超微结构改变；免疫组织化学法检测蛹虫草多糖作用后H22肿瘤组织细胞内P53蛋白的表达情况。结果：电镜观察到蛹虫草多糖作用后H22肿瘤组织细胞有早期凋亡改变，肿瘤组织内有凋亡细胞存在；免疫组化实验结果显示，蛹虫草多糖作用后H22小鼠肿瘤组织细胞突变型P53蛋白的表达水平降低。结论：蛹虫草多糖具有诱导小鼠H22肝癌细胞凋亡作用，促凋亡作用可能与其降低H22小鼠肿瘤组织细胞内突变型P53蛋白的表达有关。

蛹虫草多糖，超微结构，H22，P53，细胞凋亡

蛹虫草（Cordyceps militaris（Fr）Link）为药用虫草之一，Vaillan于1723年在《BotaniconParisiense》一书中描述了蛹虫草的自然形态、生活习性，基源鉴定，1772年在法国巴黎科学院院士年会上，被正式命名为蛹虫草，定为虫草属的模式种，其药效成分主要是虫草酸、虫草素、虫草多糖等。蛹虫草具有抗疲劳、提高机体免疫力和抗癌等作用。随着以虫草为原料的医药保健产品的不断深入开发，20世纪50年代以来，国内对蛹虫草的人工栽培技术进行了攻关式的研究，到80年代中期实现了其人工栽培，我国成为世界上大批量培养蛹虫草子实体的国家。

对蛹虫草的现代研究表明，可提高果蝇种群的寿命，具有抗衰老作用[2]；可增加脾脏和胸腺的重量，对抗可的松及环磷酰胺引起的脾脏萎缩及白细胞下降，活化T淋巴细胞、B淋巴细胞，增加抗体IgG、IgM的含量等，是很好的免疫促进剂；具有抗突变作用[3]，在抗肿瘤方面，蛹虫草水提物可抑制体外培养的BGC-823胃癌细胞、U937白血病细胞及SMMC-7721肝癌细胞生长，并诱导其细胞凋亡、蛹虫草提取物（主要成分虫草素）可降低端粒酶活性，对人结肠癌细胞SW111C生长有抑制作用[4-6]。目前对于蛹虫草多糖的研究多见于提取工艺、含量测定、分子结构、抗氧化、免疫作用等的研究，缺乏体内诱导凋亡、抗肿瘤作用的研究。细胞凋亡与肿瘤发生的关系是近年来研究的一个热点。从癌的治疗上考虑，诱导癌细胞的凋亡能使癌缩小或消失，故研究诱导癌细胞的凋亡对癌症的治疗有重要的意义。细胞凋亡已经成为评估疗效的一项新指标，进一步提高肿瘤细胞凋亡与增殖的比值是临床化疗的新要求。本课题通过制备H22移植瘤小鼠模型，探讨人工培养蛹虫草提取物——蛹虫草多糖体内诱导H22肿瘤细胞凋亡作用，旨在为抗肿瘤作用研究及蛹虫草的进一步开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级小白鼠，雄性，体重（20±2）g 黑龙江中医药大学实验动物中心；H22肿瘤细胞株 黑龙江省肿瘤研究所；蛹虫草 东北林业大学微生物教研室提供；蛹虫草多糖（CMPS）注射液 黑龙江中医药大学生化教研室；环磷酰胺、多聚甲醛 Sigma；0.1mol/L枸橼酸缓冲液、苏木素染色液、中性树胶、P53抗体、SP免疫组化检测试剂盒 北京中山生物工程公司产品；丙酮等 分析纯。

T12D326透射电子显微镜 荷兰飞利浦；AB204-N电子分析天平 瑞士METTLER；S.HH.W21-600三用电热恒温水浴箱 上海跃进医疗器械厂；LDZ4-0.8离心机 北京医用离心机厂；多媒体彩色病理图文分析系统 同济医科大学清平影像工程公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荷瘤小鼠模型制备 选择7～9d生长良好的瘤株，无菌取腹水，腹水为乳白色无絮状沉淀物者为佳，将腹水置于50mL离心管中，加入10mL 0.9%生理盐水，1000r/min离心5min，弃上清液。用0.9%生理盐水复悬，0.2%台盼蓝染色，计活细胞数大于95%，用生理盐水稀释至2×106个/mL，以0.1mL/只接种于常规皮肤消毒后的小鼠右前肢腋窝皮下。将接种后的小鼠随机分成5组：CMPS1组（25mg/kg）、CMPS2组（50mg/kg）、CMPS3组（100mg/kg）组、环磷酰胺（CTX）组、盐水组，每组15只，正常饲养。接种6h后，各组肌肉注射给药0.08mL/只，每日1次，连续给药12d，观察动物肿瘤生长情况，直至阴性对照组肿瘤达到1g以上，于末次给药24h后利用颈部脱臼方法处死小鼠，仰卧位固定，胸部用75%的酒精消毒，在右前肢腋窝剥离瘤体，然后用冷生理盐水洗涤，用滤纸吸干。

1.2.2 H22肿瘤组织电镜实验 切取各组肿瘤组织，分别放入平皿中，放入少量的固定液，切取2mm3大小的组织块，用3%戊二醛进行前固定，磷酸冲洗液冲洗，锇酸后固定，蒸馏水冲洗，丙酮梯度脱水（50%、70%、90%、100%），浸透24h，聚合24h，包埋剂812#包埋，半薄切片，超薄切片，电子染色，电镜下观察肿瘤细胞超微结构。

1.2.3 免疫组化法检测肿瘤组织p53蛋白表达 取盐水组和CMPS1组、CMPS2组、CMPS3组瘤组织，常规固定、石蜡包埋，5μm切片。石蜡切片后常规脱蜡至水，浸入3%过氧化氢溶液中，室温孵育10min后蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，用0.lmol/L枸橼酸缓冲液抗原微波修复。滴加正常山羊血清封闭，室温15min，倾去，加1∶50稀释的P53抗体4℃孵育过夜，PBS冲洗，3min×3次。洗后加生物素标记的二抗，37℃孵育15min。再用PBS冲洗后，加辣根酶标记链酶卵白素，PBS冲洗，滴加DAB染色、苏木素复染、常规脱水、中性树胶封片。空白对照用PBS取代一抗，阳性对照为已知阳性片。

1.3 数据处理

显微摄影，运用多媒体彩色病理图象分析系统分析。用SPSS 11.0软件包中的方差分析进行统计学分析。

2 结果与讨论

2.1 CMPS对H22肿瘤组织细胞超微结构的影响

电镜结果显示盐水组细胞呈多边形或菱形，核圆，核仁清晰，胞浆内可见丰富的细胞器结构（图1A）；CMPS1组大部分细胞微绒毛脱失，并可见崩解坏死的细胞碎片，大部分细胞核异染色质边集且凝集（图1B）；CMPS2组可见大量凋亡坏死细胞或凋亡崩解细胞（图1C）；CMPS3组部分细胞核碎裂，胞浆内出现大小不等的空泡状结构，核呈凋亡样结构（图1D）；CTX组部分细胞崩解坏死，并可见部分细胞核异染色质边集，细胞器模糊不清（图1E）。

图1 H22肿瘤组织细胞超微结构（2550×）Fig.1 Ultrastructure of tumor cell（2550×）

细胞凋亡是细胞由基因控制的自主过程，表现为细胞缩小，核内染色质浓缩，核质边缘化，膜发泡，凋亡小体形成等，而细胞坏死是非自主过程，其细胞膜丧失完整性和化学梯度，细胞质内容物外泄引起细胞溶解死亡[7]。细胞凋亡的定性检测依赖于形态学观察，本研究电镜结果显示CMPS1组表现出细胞凋亡的初期表现，CMPS2、CMPS3组出现明显的凋亡结构特征，CMPS各组超微结构出现明显的凋亡改变，提示CMPS具有促进H22肝癌细胞凋亡作用。细胞凋亡对机体的正常发育、生长，内环境稳态的维持等具有重要的作用。在各种致癌因素作用下，组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，可导致其克隆性异常增生而形成肿瘤。合理利用凋亡因素，干预凋亡信号转导，调节凋亡相关基因，控制凋亡相关酶的活性等，对肿瘤可起到治疗作用。蛹虫草多糖具有促进H22肝癌细胞凋亡作用，显示其在抗肿瘤方面可发挥作用。

2.2 CMPS对H22肿瘤组织细胞p53蛋白表达的影响

SP免疫组化染色后，P53阳性染色为位于细胞核的棕黄色颗粒[8]，经多媒体彩色病理图象分析系统分析表达情况。通过对面积、等效直径、形状因子、异形指数、平均光度分析，以阳性单位相对数值进行统计分析，结果见表1。

表1 CMPS对瘤组织p53蛋白表达的影响（±s）Table 1 The influence of CMPS on the expression of p53（±s）

表1 CMPS对瘤组织p53蛋白表达的影响（±s）Table 1 The influence of CMPS on the expression of p53（±s）

注：*与盐水组比较p<0.05。

组别 p53蛋白相对表达量盐水组 40.01±3.88 CMPS1 34.57±3.50* CMPS2 33.23±3.08* CMPS3 33.90±3.46*

表1实验结果表明：蛹虫草多糖各组与阴性对照组比较，对H22肿瘤组织细胞突变型p53蛋白表达有明显的下调作用（p＜0.05）。

p53基因是一种细胞凋亡相关的抑癌基因，位于细胞核内，是一种由393氨基酸组成的含磷蛋白，分子量为53ku。p53基因分为野生型和突变型两种[9]。野生型p53有“分子警察”的作用，监视细胞基因的完整性，能通过凋亡诱导细胞自杀，阻止具有癌变倾向的突变基因的细胞产生，从而起到抑癌作用。当p53基因突变后，丧失了监视细胞周期和启动细胞凋亡程序的能力，而使细胞增殖失控，与许多肿瘤发生发展密切相关[10-11]。正常细胞中野生型p53所表达的蛋白由于半衰期极短，通常免疫组化的方法检测不出来；而突变型p53基因为致癌基因，它所表达的蛋白由于半衰期较长，可通过免疫组化方法检测到[7]。本实验采用免疫组化法检测了H22肿瘤组织中p53蛋白表达情况，结果显示，蛹虫草多糖低、中、高剂量组对H22肿瘤组织细胞突变型p53蛋白表达有明显的下调作用（p＜0.05）。

上述研究结果表明，蛹虫草多糖可诱导H22肿瘤组织细胞凋亡，可能与凋亡相关基因肿瘤组织突变型p53的表达降低有关，进一步的作用机制有待探讨。结合蛹虫草多糖具有抗氧化、调节免疫等的生物活性，提示其对机体的作用是多方面的，多方面协同可能更有利于调节机体的内在平衡，有益于肿瘤的防治。

3 结论

实验将蛹虫草多糖体内应用于H22荷瘤小鼠，使H22移植瘤细胞超微结构出现明显的凋亡样改变，并使肿瘤组织突变型p53蛋白表达降低，提示蛹虫草多糖可诱导H22小鼠移植型腹水型肝癌细胞凋亡，具有抗肿瘤作用。诱导肿瘤细胞凋亡机制可能与其降低凋亡相关基因突变型p53的表达有关。

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Effect of Cordyceps militaris polysaccharide on ultrastructure of tumor transplanted with hepatoma cells

GUO Li-xin1，2，FENG Zhe3，QI Yan2，WEI Bo-yang2，WANG Shi-long2，ZHAO Min1，*
（1.Department of Microbiology，College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Department of Biochemistry，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；3.College of life Science and Technology，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

Objective：To evaluate the effects of Cordyceps militaris polysaccharides（CMPS）on apoptosis of tumor transplanted with hepatoma cells in mice（H22）in vivo and explore the anti-tumor mechanism.Methods：Establish H22 xenograft mouse model，electron microscope was used mehod to observe the ultrastructural changes of H22 in tumor bearing mice.P53 protein expression in H22 tumor cells was detected by immunohistochemistry method.Results：CMPS could reduce apoptosis in H22 hepatoma cells in mice.Conclusion：The apoptosis may be related to its decreasing mutant P53 protein expression in tumor tissue in mice.

Cordyceps militaris polysaccharide；ultrastructure；H22；P53；apoptosis

TS201.3

A

1002-0306（2014）08-0139-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.022

2013－11－25 *通讯联系人

郭丽新（1967-），女，博士，副教授，研究方向：微生物制药。