记忆性T细胞在移植物抗宿主病中的作用的动物模型的建立

张萍，王椿

记忆性T细胞在移植物抗宿主病中的作用的动物模型的建立

张萍，王椿

目的探讨记忆T细胞在移植物抗宿主病（GVHD）中的作用。方法用BALB/c小鼠致敏C57BL/6小鼠，8周后从C57BL/6小鼠分选出CD62L－记忆性T细胞移植给BALB/c受鼠，比较CD62L+初始T细胞与CD62L－记忆性T细胞引起GVHD的能力差异。结果接受CD62L+初始T细胞回输的受鼠35 d内全部死亡；接受CD62L－记忆性T细胞回输的受鼠100 d内存活率为89%；接受CD62L+与CD62L－混合细胞回输的受鼠100 d内存活率为4%，生存分析结果显示CD62L+与CD62L－受鼠组间生存率差异有统计学意义（＜0.01），CD62L－受鼠组与全骨髓移植组间生存率差异无统计学意义（=0.337）。第7天体质量变化CD62L－受鼠组相比于CD62L+受鼠组差异有统计学意义（＜0.01）。结论CD62L－记忆性T细胞不引起GVHD，此种模型可以用来研究抗原特异性记忆性T细胞在移植物抗宿主病中的作用及其机制。

移植物抗宿主病；记忆性T细胞；动物模型

异基因造血干细胞移植为很多恶性血液病患者提供了治愈的希望[1]，然而干细胞移植后经常发生的移植物抗宿主病（GVHD）严重影响了患者的生活质量，如何减轻甚至避免GVHD已经成为目前移植免疫研究的重点。本实验拟建立抗原特异性记忆T细胞动物模型以用来评估抗原特异性记忆性T细胞在GVHD中的作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料受体鼠为SPF级近交系BALB/c（H-2d）小鼠，雌性，8～12周龄；供体为SPF级近交系C57BL/6（H-2b）小鼠，雌性，6～8周龄；均购自中科院上海实验动物中心。所有抗体除特殊说明外均购自BD公司，包括抗C D62LFITC（克隆MEL-14），抗CD45APC-cy7（克隆30F11），抗CD3PE-cy5（克隆145-2C11）；此外实验还使用RPM I1640培养基（Gibco）；胎牛血清（FBS，Sigma）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma）；红细胞裂解液（ACK，实验室配置）；流式红细胞裂解液（BD）；4%台盼蓝母液（Sigma）；T细胞分选试剂盒（M iltenyi）；兔血清补体（Cedarlane）；细胞毒性培养液（RPM I+0.3%BSA）等。

1.2 抗原特异性记忆性T细胞供鼠的准备BALB/c小鼠经颈椎脱臼处死后取出脾脏，研磨破碎并裂解红细胞，洗涤离心后获得的脾细胞经2 000 cGY照射去除增殖能力，腹腔注射至C57BL/6小鼠体内，8周以后致敏C57BL/6小鼠即准备好。

1.3 供鼠去T细胞骨髓和对照组脾细胞的准备取6～8周C57BL/6小鼠两侧股骨、胫骨及肱骨，盛于50m l完全RPM I培养基的培养皿中，用1 m l注射器吸取培养基，冲出骨髓，制备骨髓细胞悬液离心后弃去上清，按照1×107/m l浓度重悬于细胞毒性培养液中，按照每1×107细胞加入抗-Thy1.2单克隆抗体（克隆为30H 12，BD Pharm ingen）0.1 g的浓度，混合均匀后4℃孵育1 h，离心去上清，重悬于含有1∶10Low-Tox-M兔补体（Cedarlane）的细胞毒性培养液中，37℃孵育1 h，离心洗2遍后细胞计数，待用。此种方法得到的骨髓细胞含有少于0.08%的成熟T细胞。

1.4 流式分选抗原特异性T细胞BALB/c小鼠致敏的C57BL/6小鼠经颈椎脱臼处死后去除脾脏并研磨破粹获取脾细胞。裂解红细胞后采用T细胞分选试剂盒获得纯化的T细胞，再经免疫磁珠分选，以CD45+CD 3+射门，获得CD62L+初始T细胞亚群与CD62L－记忆T细胞亚群。

1.5 实验分组根据T细胞种类设计4组动物，分别为去T细胞骨髓移植组，骨髓细胞+CD62L－记忆T细胞亚群移植组，骨髓细胞+CD 62L+初始T细胞亚群移植组，骨髓细胞+混合T细胞移植组。

1.6 异基因骨髓移植GVHD模型的建立BALB/c受者小鼠首先接受10.5GY致死量照射，随后经尾静脉回输1×107去T细胞骨髓（TCD-BM）和供者T细胞（除非特殊说明，否则T细胞量为1×105）。受鼠每周测量体质量，每天观察生存状况和GVHD症状，包括皮肤改变（脱毛、

红斑等）、腹泻及驼背症等。如果小鼠处于濒死状态即连续2周体质量下降超过20%则执行人道处死。

1.7 统计方法采用SPSS17.0统计软件进行分析，生存分析采用Long Rank检验，＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GVHD发生情况初始T细胞移植组小鼠急性GVHD症状非常明显，混合T细胞移植组的急性GVHD症状也非常明显。CD62L－记忆性T细胞移植组小鼠急性GVHD症状不明显，和去T细胞骨髓移植组类似。

接受CD62L+初始T细胞回输的受鼠移植后4～5 d即开始出现急性G VHD症状，35 d内全部死亡，中位生存时间为19.5 d；接受CD62L－记忆性T细胞回输的受鼠100 d内存活率为89%；细胞回输的受鼠100d内存活率为4%，中位生存时间为42d；接受去T细胞骨髓移植的受鼠100d存活率100%。LongRank检验显示，CD62L+与CD62L－受鼠组间生存率差异有统计学意义（=0.001），CD62L－受鼠组与全骨髓移植组间生存率差异无统计学意义（=0.337）。第7天体质量变化1×105CD62L－受鼠组相比于1×105CD62L+受鼠组差异有统计学意义（=0.00027），第7、14和42天1×105CD62L－受鼠组相比于混合细胞回输组差异有统计学意义（均＜0.01）。见封四彩图5，6。

2.2 病理学检查CD62L+初始T细胞移植组和混合T细胞移植组肝脏、结肠病变，以结肠病变最为显著，镜下显示发生GVHD组动物结肠正常结构遭到破坏，肠壁不完整，细胞坏死；CD62L－记忆T细胞移植组和单纯骨髓细胞移植组肠壁结构完整，细胞完好。见封四彩图7。

3 讨论

随着造血干细胞移植广泛应用于各种恶性血液疾病和干细胞来源疾病的治疗，移植后GVHD越来越成为研究的热点，近年来研究T细胞在GVHD中的作用越来越深入，尤其是T细胞亚群在GVHD中的作用得以重新评估[1-3]。记忆性T细胞因其独特的抗原识别能力而备受重视，非抗原特异性记忆性T细胞不引起GVHD可能是因为他们不是抗原特异性的记忆性T细胞，同时这种记忆性T细胞可以保持其免疫记忆功能并在移植物抗肿瘤效应中起作用[4]。由于抗原特异性记忆性T细胞在免疫排斥和移植排斥中对抗原特异性识别，有必要研究这种抗原特异性记忆性T细胞在GVHD中的作用。

现有对记忆性T细胞的研究多针对非抗原特异性记忆性T细胞，这种T细胞是一群识别不同抗原的混合T细胞，而针对抗原特异性记忆性T细胞的动物模型大都是通过过继性细胞转移产生大量抗原特异性记忆性T细胞[3]，虽然这样可以研究某种独特抗原特异性记忆性T细胞的功能，甚至单个细胞，但是记忆性T细胞产生的环境是基于淋巴细胞减少及缺少初始T细胞的环境，这种特殊环境是否会影响记忆T细胞的功能尚不得而知，建立一种能够产生自然状态下的记忆性T细胞模型来研究其在GVHD中的作用是进一步进行机制探讨的关键。本实验中，选用经典的C57BL/6→BALB/c作为供受者诱导急性GVHD，同时使用BALB/c免疫刺激过的C57BL/6产生的记忆性T细胞作为记忆性T细胞来源，通过此模型可以生成稳定的记忆性T细胞，而且这种T细胞是特异性针对宿主抗原的，正好可以用来研究抗原特异性记忆性T细胞不引起GVHD的机制。

综上所述，抗原特异性记忆T细胞并不是根据是否见过抗原而决定是否会产生GVHD。自然状态下机体产生的TEM不能引起GVHD，结合现有的研究结论，即自然状态下产生的TEM可以骨髓移植后的免疫重建，并仍具有GVL作用[5]，使得记忆性T细胞在骨髓移植治疗恶性血液病方面的前景十分可观。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.05.047

R733

A

1671-0800(2014)05-0589-02

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