非小细胞肺癌吉西他滨化疗敏感性预测

吴 鹏 徐佳佳 王国庆 冯俊志 施 风

1.江苏建康职业学院医学护理系，江苏南京211800；2.东南大学附属中大医院病理科，江苏南京210009

非小细胞肺癌吉西他滨化疗敏感性预测

吴 鹏1徐佳佳2王国庆2冯俊志1施 风1

1.江苏建康职业学院医学护理系，江苏南京211800；2.东南大学附属中大医院病理科，江苏南京210009

目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）吉西他滨（GEM）化疗敏感性预测靶标。方法30例NSCLC组织，体外药敏试验明确GEM IC50值；Realtime-PCR检测GEM代谢酶hENT1、dCK、RRM1和RRM2mRNA表达水平。结果hENT1、dCK、RRM1和RRM2单个基因表达量与GEM IC50值无关（P＞0.05）；（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）值与GEM IC50值呈负相关（P＜0.001）。结论（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）值可作为GEM化疗敏感性预测的潜在标志物。

非小细胞肺癌；吉西他滨；化疗敏感性；原代细胞

非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌80%以上，大多数患者在初诊时即有局部或远处转移，手术的机会受到限制，因此化疗仍是NSCLC临床治疗的重要手段。吉西他滨（Gemcitabine，GEM）是新一代阿糖胞苷类似物，属抗代谢类抗肿瘤药[1]，临床上一线应用于NSCLC、胰腺癌、进展期膀胱癌和蒽环类失败的转移性乳腺癌的治疗[2]，但GEM的原发性与继发性耐药使其临床应用受到限制，目前尚缺乏较为有效指标来预测肿瘤细胞对此药物的敏感性。多个关键酶参与GEM在体内的代谢调节，这些关键酶的表达水平可能直接影响到机体对GEM的药物敏感性[3]。本实验拟在NSCLC标本中检测GEM代谢酶hENT1、dCK、RRM1和RRM2mRNA表达水平，通过体外药敏试验分析其与GEM化疗敏感性的关系，明确其指导NSCLC个体化治疗的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

30例初治NSCLC患者的术后组织标本源自2012年1月～2012年6月于江苏省肿瘤医院和东南大学附属中大医院胸外科住院患者，标本离体30 min内无菌收集，每份标本一分为二，一份用于体外药敏试验，一份用于基因表达检测。所有患者均经病理检查确诊。标本采集经患者知情同意并得到医院伦理委员会批准。

1.2 体外药敏试验

取新鲜癌组织约1 g（1 cm3），用Hank's液反复冲洗，洗去血细胞并尽量剔除其中的黑色颗粒物及非癌组织，机械法制成单细胞悬液[4]。台盼蓝染色计数活细胞数，调整细胞浓度为（2～5）×105/m L。取GEM浓度序列为0、1.0、5、10、20、40、80、160、320、640μmol/L。将上述单细胞悬液接种于96孔板（4000个/孔），每个浓度设3个平行实验孔。待细胞贴壁后分别加入含GEM相应浓度的培养液培养48 h。空白孔和对照孔为减除背景用。采用MTT法测定细胞生存率，检测波长492 nm。细胞生存率=光密度（实验孔-空白对照）/光密度（正常对照-空白对照）。实验重复3次。用Graphpad Prism 5.0软件绘制各组细胞对GEM的量效曲线并计算IC50。

1.3 Realtime-PCR

采用Trizol（美国Invitrogen公司）一步法提取癌组织总RNA，紫外分光光度计定量，取2μg RNA进行逆转录反应（1st Strand cDNA Synthesis Kit，Takara公司，大连）。Rrealtime PCR反应体系依照Takara公司SYBR premix ExTaqTM试剂盒说明配置。利用ABI7300仪器对hENT1、dCK、RRM1和RRM2 mRNA表达进行检测，β-actin作为内参。引物序列和退火温度见表1。上机反应条件为：变性95℃，15 s；退火56～60℃，30 s；延伸72℃，30 s，45个循环。每个实验组行两次以上有效重复，平行做目的基因和内参基因，每个反应做3个完全一致的PCR仪器孔重复。目的基因的mRNA相对表达量用2-ΔΔCt法分析。

表1 引物序列及产物长度

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，基因表达与GEM化疗敏感性的关系采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代肿瘤细胞生长状况及形态学表现

NSCLC原代细胞培养30例均成功，传3～5代后仍保持稳定。细胞呈贴壁生长，形态各异，呈梭形、三角形、多角形等，细胞轮廓清楚，胞浆均质透明，核圆形，单核或多核。见图1。

图1 非小细胞肺癌原代细胞培养

2.2 代谢酶表达与GEM化疗敏感性

NSCLC原代细胞对GEM的IC50值为10～400μmol/L。计算每例标本的hENT1、dCK、RRM1和RRM2相对表达量，与该例标本的IC50值进行相关性分析，可见hENT1和dCK表达量与IC50值有负相关的趋势，RRM1和RRM2表达量与IC50值有正相关的趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。然而，（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）与吉西他滨的IC50值呈负相关（r= -0.851，P＜0.001）。见图2。

图2 代谢酶表达与GEM IC50的关系

3 讨论

原代肿瘤细胞因刚从组织中分离，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传学特性，也最接近体内细胞生长特性，是理想的基因表达和药物毒性实验对象。本实验培养的原代NSCLC细胞不排除混杂有部分成纤维细胞等肿瘤间质细胞，考虑到肿瘤间质成分对化疗耐药也具有重要意义，尚有部分体外药敏试验采用肿瘤组织块培养法进行[5]，因此未作进一步分离、鉴定。

GEM系胞嘧啶核苷衍生物，主要通过人平衡型核苷载体1（human equilibrative nucleoside transporters 1，hENT1）和浓度型核苷载体（human concentrative nucleoside transporters 1，hCNT1）进入细胞，在胞浆内，GEM被脱氧胞苷激酶（deoxycytidine kinase，dCK）磷酸化为双氟脱氧胞苷一磷酸（difluorodeoxycytidine monophosphate，dFdCMP），后者继续活化为双氟脱氧胞苷二磷酸（dFdCDP）及双氟脱氧胞苷三磷酸（dFdCTP）活性产物。dFdCDP抑制核苷酸还原酶（ribonucleotide reductase，RR）的活性，使细胞内DNA合成与修复所必需的原料脱氧二磷酸核苷减少，从而进一步抑制DNA的合成；dFdCTP是一种DNA多聚酶抑制剂，抑制DNA链延长，使DNA复制提前终止，它的浓度增加还将抑制dCMP脱氨酶，减少dFdCMP代谢，使药物活化增加，自我强化其细胞毒的作用[6]。

hENT1是GEM在细胞膜上的主要载体。体外研究表明，22株NSCLC细胞株中hENT1的表达水平与GEM的IC50值明显相关，以腺苷转运抑制剂处理细胞可降低其对GEM的敏感性[7]，说明hENT1对NSCLC细胞系的药物敏感性具有重要作用。Oguri等[8]对24例NSCLC患者研究表明，hENT1表达与含有GEM化疗的客观缓解有关，7例hENT1不表达的患者对GEM化疗无效。也有研究发现，hENT1mRNA高表达的NSCLC患者并不能从吉西他滨治疗中获益[9]。

dCK可催化多种特异性底物的磷酸化反应，是重要的代谢调节酶，dCK活性降低或表达量减少可使细胞内核苷酸库平衡失调，导致肿瘤细胞对吉西他滨的耐药。研究表明，以dCK的自然底物2'-脱氧胞苷酸处理胰腺癌和NSCLC细胞株，可降低GEM的细胞毒性[10]；通过RNAi下调dCK的表达导致胰腺癌对吉西他滨发生继发耐药现象[11]。Kroep等[12]对包括NSCLC在内的7种不同肿瘤模型的研究发现，dCK蛋白表达和dCK酶的活性与吉西他滨的敏感性呈正相关。通过免疫组化分析44例胰腺癌组织中的dCK表达强度，发现dCK高水平组的总生存期明显优于dCK低水平组[13]。

RR是细胞内唯一具有催化核糖核酸还原为脱氧核糖核酸功能的酶，在DNA合成与修复过程中发挥关键作用。RR基因包含2个亚单位M1与M2，其中，RRM1亚基是吉西他滨作用的主要靶点。体外实验显示，RRM1的表达上调3倍，吉西他滨的IC50值上升8倍，RRM1的表达下调则出现相反的趋势[14]。在GEM高度耐药的胰腺癌细胞系MiaPaCa2-RG中通过RNAi下调RRM1的表达可提高其对GEM的敏感性；在18例GEM术后辅助治疗的胰腺癌患者中，RRM1高表达者较低表达者预后更差（P=0.016）[15]。Rosell等[16]发现，100例以吉西他滨/顺铂方案进行化疗的NSCLC患者，RRM1低表达的总生存期明显高于高表达者，分别为13.7个月和3.6个月（P=0.009）。胆管癌细胞中，RRM1、RRM2表达与GEM的IC50值呈负相关，并且，RRM1低表达的胆管癌患者对GEM的治疗有效性与总生存均优于高表达者[17]。

由于GEM代谢过程中涉及多个关键代谢酶，所以，其药理作用也必然同时受多因素的影响。在GEM的代谢路径上，单一某个因素的升高或降低可能仅是其他因素障碍导致的代偿结果。如Nakano等[18]报道，胰腺癌细胞系的获得性耐药与单一的GEM代谢酶hENT1、dCK、RRM1和RRM2 mRNA表达水平无关，而是取决于四个因子间的平衡，（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）值与吉西他滨的IC50值呈反比。另一项研究在70例以吉西他滨为主化疗的胰腺癌患者中检测hENT1、dCK、CDA、RRM1和RRM2 mRNA的表达，发现高dCK表达，低RRM2表达以及5个基因的综合评分与患者无进展生存相关[19]。

本实验发现，单个代谢酶基因表达量与原代NSCLC细胞GEM IC50值无关，但（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）值与GEM IC50值呈负相关，可能作为GEM化疗敏感性预测的潜在标志物，值得临床进一步关注。鉴于既往研究的NSCLC化疗敏感性的靶标仍未得到广泛认可[20]，本实验结果可望为临床指导NSCLC个体化化疗提供新的思路。

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Study of Gem citabine chemosensitivity prediction in non-small cell lung cancer

WU Peng1XU Jiajia2WANG Guoqing2FENG Junzhi1SHIFeng1
1.Department of Nursing,Jiangsu Jiankang Vocational College,Jiangsu Province,Nanjing 211800,China;2.Department of Pathology,Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University,Jiangsu Province,Nanjing 210009,China

Objective To explore biomarker of Gemcitabine(GEM)chemosensitivity in non-small cell lung cancer (NSCLC).M ethods GEM IC50of 30 NSCLC tissueswere detected by susceptibility testing in vitro,mRNA expression of hENT1,dCK,RRM1 and RRM2 were determined by Realtime-PCR.Results hENT1,dCK,RRM1 or RRM2 expression levels in individual gene had no relationship with the GEM IC50value(P＞0.05),however,ratio of(hENT1×dCK)/ (RRM1×RRM2)was negatively correlated with GEM IC50value(P＜0.001).Conclusion Ratio of(hENT1×dCK)/ (RRM1×RRM2)may predict GEM chemosensitivity in NSCLC.

Non-small cell lung cancer;Gemcitabine;Chemosensitivity;Primary culture cell

R734.2；R730.54

A

1673-7210（2014）08（b）-0043-04

2014-05-06本文编辑：程铭）

江苏建康职业学院院级教科研项目（编号JK20 1104）。

吴鹏（1978-），男，医学硕士；研究方向：肿瘤学。