高效液相色谱法测定六叶龙胆不同部位的龙胆苦苷含量

孙晓 郭耀武 杨瑞瑞

1.陕西中医学院，陕西咸阳712046；2.陕西省食品药品检验所，陕西西安710065

高效液相色谱法测定六叶龙胆不同部位的龙胆苦苷含量

孙晓1郭耀武2杨瑞瑞2

1.陕西中医学院，陕西咸阳712046；2.陕西省食品药品检验所，陕西西安710065

目的采用高效液相色谱法测定六叶龙胆不同部位的龙胆苦苷含量，比较不同部位龙胆苦苷的含量。方法CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为甲醇-0.5%乙酸水溶液（25∶75）；检测波长为270 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为32℃。结果龙胆苦苷在0.5～6.9 μg范围内呈线性关系，回归方程为Y=1.2908×106X+ 4.8047×104，相关系数（r）=0.9999，测定方法的平均回收率为98.56%，RSD=1.01%（n=6）。龙胆苦苷含量测量结果为：花＞根＞茎＞叶＞枯龙胆。结论本研究所采用的高效液相色谱法快速简便，准确，精密度好；六叶龙胆不同部位中龙胆苦苷含量有较大差异。

高效液相色谱法；六叶龙胆；不同部位；龙胆苦苷

龙胆科龙胆属植物全世界约有400余种，我国有240余种，分布遍及全国[1]。六叶龙胆（Gentiana hexaphylla Maxim.ex Kusnez.）为龙胆科龙胆属的多年生草本植物。六叶龙胆出自《青藏药鉴》，书中记载藏药名称为吉解那保。主要分布在中国内地的甘肃、西藏、青海、四川、陕西秦岭等高海拔地区，主要生长在海拔2500～3500 m的山坡草地、路旁、高山草甸及灌丛中[2]，是秦岭北坡关中中部的习用草药之一，目前尚未由人工引种栽培，蕴藏量较大。

已有文献报道称龙胆科植物的主要活性成分为环烯醚萜苷类化合物，包括龙胆苦苷、马钱酸、獐牙菜苦苷及獐芽菜苷等[3]。其中具有强烈苦味活性的龙胆苦苷是其主要有效成分之一，是龙胆药苦寒的物质基础[4]，具有保肝、利胆、抗炎、抗过敏、健胃等多种药理作用，是评价龙胆药材质量的重要指标[5-6]。

近年来龙胆商品药材使用量加大，但由于长期无序采挖导致野生资源锐减，部分地区资源枯竭[7]。为扩大药用资源，本文对六叶龙胆不同部位的主要化学成分龙胆苦苷含量做了比较，对今后合理开发利用这一药用植物资源提供指导。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AD型液相色谱仪；色谱柱；CAPCELL PAK C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；电子分析德国赛多利斯Sartorius BP系列天平；KQ500DE台式数控超声波清洗器；大德药机摇摆式离心机。

1.2 材料与试药

本文所采用实验材料六叶龙胆均采自秦岭，采挖时间为7～9月份，经陕西省食品药品检验所郭耀武主任药师鉴定为龙胆科植物六叶龙胆（Gentiana hexaphylla Maxim.ex Kusnez.），其中编号1的样品采自户县光头山，编号2的样品采自周至县厚畛子，编号3的样品采自长安县终南山。

龙胆苦苷对照品（供含量测定用，含量以96.9%计，批号为110770-201013）购自中国药品生物制品检定所；实验过程中所用试剂均为国药“沪试”牌分析纯，流动相为色谱纯，微孔滤膜统一为0.45 μm有机系尼龙微孔滤膜，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：CAPCELLPAKC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.5%乙酸水溶液（25∶75）；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL/min[8]；进样量：10 μL；柱温32℃。理论塔板数以龙胆苦苷计算应不低于4500。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取龙胆苦苷对照品10 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.4 mg/mL的溶液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，作为对照品溶液，备用[9]。

2.2.2 供试品溶液的制备分取六叶龙胆干燥根、茎、叶、花、全草、枯六叶龙胆等六部分，分别放于旋转式离心机中粉碎。精密称取各部位粉末各0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，称定并记录重量[10]。考虑到龙胆苦苷自身的不稳定性会导致分解从而提取率下降，故超声处理分为两阶段[11]。第一阶段超声频率设置为500 W，超声时间设置为15 min，取出自然冷却至室温，第二阶段再次超声15 min，频率设置依旧为500 W。超声结束后取出冷却至室温后称定重量，对比超声前重量记录，用甲醇补定减失重量。振摇后静置取上清液，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为供试品溶液[12-13]。

2.3 系统适应性试验

按上述色谱条件，将制备好的对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，结果供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处有一致的色谱峰，且吸收峰达到基线分离，分离度均大于1.6，理论塔板数均大于4500，说明上述色谱条件适用于六叶龙胆中龙胆苦苷含量测定。见图1。

图1 龙胆苦苷的高效液相色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，按上述色谱条件依次进样，以对照品进样量为横坐标，相应峰面积为纵坐标，计算得回归方程Y=1.2908× 106X+4.8047×104，相关系数（r）=0.9999，计算结果表明龙胆苦苷在0.5~6.9 μg之间线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取龙胆苦苷对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下连续重复进样5次，记录每次峰面积，计算得RSD为1.10%，表明本实验方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

取按上述制备条件制备的对照品溶液和供试品溶液，分别精密吸取10 μL，在18 h内各进样5次，各自记录峰面积，计算得到对照品溶液的RSD值为0.55%（n=5），结果表明对照品溶液在18 h内稳定性良好；供试品溶液的RSD值为0.98%（n=5），表明供试品溶液在18 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同批六叶龙胆样品按上述方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱测定条件方法，测定，记录各自峰面积，计算RSD为1.10%（n=6），结果表明，本方法重复性良好。

2.8 回收率试验

精密称取已知含量的六叶龙胆全草样品6份，分别精密加入龙胆苦苷对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。测定并计算其各自的回收率，然后计算得到平均回收率为98.56%，RSD为1.01%（n=6），结果表明，本实验方法可行。见表1。

表1 龙胆苦苷回收率实验结果（n=6）

2.9 样品含量测定

分别取六叶龙胆根，茎，叶，花，全草，枯龙胆干燥粉末，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，各平行制备2份，每份精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪进行含量测定。见表2。

表2 含量测定结果

3 讨论

3.1 龙胆苦苷含量测定

《中国药典》2010年版龙胆项下规定的龙胆苦苷含量限度龙胆不少于3.0%，坚龙胆不少于1.5%[14-16]。本文六叶龙胆测定结果根含量为1.74%，花含量为2.91%，全草含量1.02%，表明六叶龙胆确有一定的应用价值。

3.2 提取条件研究

3.2.1 提取时间的考察按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法，对六叶龙胆提取时间进行考察，分为15、30、45、60 min，结果发现随着超声波提取时间的延长，提取率在30 min前呈上升趋势，30 min后趋于平缓。

3.2.2 料液比的考察按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法，设定料液比为1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，结果发现随着提取溶剂比例的不断加大，提取率呈上升趋势，并在料液比1∶50后趋于平缓。

3.2.3 提取条件的确定比较静态热回流提取法、动态热回流提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等方法各自的提取率。综合温度因素对龙胆苦苷稳定性的影响，考虑到龙胆苦苷自身的对热不稳定性，可能会导致龙胆苦苷分解从而使提取率下降。最终确定提取条件为：料液比1∶50、超声处理两阶段。第一阶段超声频率设置为500 W，超声时间设置为15 min，取出自然冷却至室温，第二阶段再次超声15 min，频率依旧设置为500 W。

3.3 六叶龙胆采收时间

六叶龙胆根部相比《中国药典》2010年版收录的龙胆药材根部较小，其主要药理成分龙胆苦苷在六叶龙胆各个部位有所不同，其中以花中含量最大，为2.91%，根中次之，为1.74%，茎叶中龙胆苦苷含量较低，提示应在盛花期7～9月份采挖。

3.4 六叶龙胆入药部位

六叶龙胆资源主要在秦岭高海拔区域分布，六叶龙胆植株较小且全草均含有龙胆苦苷，总体含量在1.0%以上，考虑到药用植物资源的充分利用，建议以全草入药，考虑到六叶龙胆往年生的干枯植株根系中龙胆苦苷含量仅为0.1%，故建议在六叶龙胆产地加工时需把根部干枯的植株根系剔除。

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Determination of gentiopicroside in different parts of the Gentiana hexphylla by HPLC

SUN Xiao1GUO Yaowu2YANG Ruirui2
1.Shaanxi University of Chinese Medicine,Shaanxi Province,Xianyang712046,China;2.Shaanxi Institute for Food and Drug Control,Shaanxi Province,Xi′an710065,China

Objective To compare gentiopicroside content in different parts of the Gentiana hexphylla by HPLC,and in order to compare the content of gentiopicrin in different parts.Methods The HPLC analysis was performed on a CAPCELL PAK C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with methanol-0.5%acetic acid(25∶75)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min;the detection wavelength was at 270 nm;the column oven temperature was set at 32℃.Results The gentiopicroside content showed good linear in the range of 0.5-6.9 μg,regression equation:Y=1.2908×106X+4.8047× 104,correlation coefficient(r)=0.9999.The average recovery was 98.56%,RSD=1.01%(n=6).The sequence of gentiopicroside content was flower＞root＞stem＞leaf＞wither.Conclusion The method of HPLC is quick,simple,accurate,reliable and good precision.There are obvious differences between the kind of different parts of Gentiana hexphylla. [Key words]HPLC;Gentiana hexaphylla;Different parts;Gentiopicroside

R284.1

B

1673-7210（2014）09（a）-0095-04

2014-05-23本文编辑：卫轲）

国家中医药管理局中医药行业科研专项课题（编号201207002）；陕西省中医管理局中医药科研课题（编号13-ZY054）。

孙晓（1988.2-），男，陕西中医学院2012级中药学专业在读硕士研究生。

郭耀武（1963.5-），男，陕西西安人，主任药师，硕士研究生导师，陕西省食品药品检验所质量管理科科长；研究方向：中药资源与开发利用。