桑叶对肿瘤血管生成的影响

王志雄 高剑文 缪伟伟

1.上海理工大学，上海200093；2.上海医疗器械高等专科学校医疗器械工程系，上海200093

桑叶对肿瘤血管生成的影响

王志雄1，2高剑文1缪伟伟1，2

1.上海理工大学，上海200093；2.上海医疗器械高等专科学校医疗器械工程系，上海200093

目的研究桑叶对肿瘤血管生成中血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响。方法用CCK-8试剂盒测定HUVEC-2C细胞数量的变化；用Transwell转移小室研究HUVEC-2C细胞迁移情况；用包被Matrigel的24孔板来培养HUVEC-2C细胞观察其管腔形成情况。实验分为实验组和对照组，每组分别设置3个复孔，在实验组中加入桑叶浸出液。观察桑叶对肿瘤血管生成的影响。结果桑叶液可抑制HUVEC-2C细胞的增殖能力，抑制作用随着浓度的增长而增强。在浓度为100、50、25 mg/mL时，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。当浓度为100 mg/mL的桑叶液时细胞增殖抑制率可达到37.6%。通过观察Transwell小室，与对照组比较，添加了桑叶液的HUVEC-2C细胞，其迁移能力受到一定的制约作用。Matrigel实验中，与未加入桑叶液的HUVEC-2C细胞所形成的较完整的环状结构比较，加入桑叶液的HUVEC-2C细胞在管腔形成方面受到明显的抑制作用。结论桑叶液通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，对肿瘤血管的生成具有抑制作用。

桑叶；肿瘤血管；内皮细胞；增殖；迁移；管腔形成

1971年，Folkman[1]首次提出血管生成与肿瘤生长之间的关系问题。随后许多研究陆续证明，肿瘤形成初期，肿瘤细胞能够通过弥散方式获取营养物质。但长到一定大小后，必须从最近的血管处诱导形成自身血管。如果没有血管生成这一过程，肿瘤就会因得不到足够的营养和氧气而进入休眠阶段，甚至坏死[1]。血管为肿瘤生长提供营养和氧气，也是其排泄的通道，更是转移的必要条件[2]。这就为治疗肿瘤提供了一个新思路——通过阻断肿瘤血管的生长，切断肿瘤营养与氧气的供应，从而抑制肿瘤的发生和发展。肿瘤血管与正常血管存在很大差异，但无论是肿瘤血管还是正常的血管，血管内皮细胞（endothelial cell）都是血管的主要组成部分，衬贴于血管内壁。

目前，市场上销售的血管生成抑制药物大都成本高昂，作用途径比较单一，治疗不够彻底，副作用仍然较大，在实际应用中存在一些问题。近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构发生了显著变化，世界各地相关学者专家都在极力寻求天然、安全、保健性食品药品的开发，这种回归自然的愿望已成为走向21世纪的趋势。探寻引起不良反应小的植物成分药已成为血管生成抑制剂发展的重要方向[3]。特别是低价易得植物材料，不但可以解决恶性肿瘤早期防治问题，同时也可充分降低治疗成本，给更多癌症患者提供更大的生存机会。

桑叶，作为古老的中药，其味甘、性平、寒，具有清肝明目聪耳，镇静神经，润肺热，止咳的作用。近年来，有关学者致力于对天然、安全、保健性药食品的开发，通过对桑叶化学成分及生理功能的研究，发现其含有的黄酮类、生物碱等生物活性成分，具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老等功效，还能预防肿瘤细胞的生成[4-8]，被国家卫生和计划生育委员会列为药食两用植物。特别是类黄酮中的槲皮素能够抑制多种肿瘤细胞的分裂增殖，通过多种途径促进其凋亡，抑制肿瘤细胞迁移及侵袭，降低其耐药性等作用[9-13]。笔者从血管生成抑制方面来研究桑叶中有效成分对肿瘤生长的影响。

本课题通过探讨低价易得植物材料桑叶中的有效成分对肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移以及管腔形成的作用，来探索其对肿瘤血管生成的抑制作用，判断桑叶有效成分抑制肿瘤血管生成的可行性，从而为肿瘤早期预防和治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

桑叶（日本株式会社黑姬和汉药研究所）；HUVEC-2C（Cascade biologics公司，批号C-003-2C）；PBS（pH为7.4，实验室配制）；DMEM高糖培养基（Biowest公司提供）；细胞消化液（Trypsin0.25%-EDTA0.02%，Biowest公司提供）；胎牛血清（South America Origin，Biowest公司提供）；双抗（青霉素-链霉素，碧云天生物研究所提供）；CCK-8（上海博谷公司）；Matrigel（威格拉斯生物公司提供）。

1.2 实验设备

超净工作台（SW-CJ-1B，苏州安泰）；电子天平（FA2104，上海舜宇恒平）；二氧化碳培养箱（CPST100A，长沙长锦科技）；超声处理仪（JY92-ⅡDN，宁波新芝生物科技股份有限公司）；旋转蒸发器（RE-52CS，上海雅荣生公司）；酶标仪（DNM-9602G北京普朗公司）；倒置生物显微镜（LWD200-37T，上海测维光电）等。镊子；手套；无菌针管；0.22 μm针头过滤器；2 mL PE试管；50 mL离心管；烧杯；量筒；双蒸水；培养皿；离心管；25 mL细胞培养瓶（Corning）；96孔细胞培养板（Corning）；3 mL巴氏吸管（Corning）；Transwell转移小室（Corning）；血球计数器。

1.3 方法

1.3.1 桑叶有效成分的提取[14-15]精确称取桑叶粉3.00 g，浸泡于60 mL 75%的乙醇中。在50℃、20～25 kHz超声频率下超声30 min后过滤，并将滤渣用60 mL 75%的乙醇再次超声30 min。将得到的两次滤液合并超声混匀，再用0.45 μm的滤纸过滤。滤液用旋转蒸发器在0.08 mPa、60℃的环境下蒸发2.5 h以去除乙醇，得到的溶液定容至30 mL。之后使用0.22 μm的一次性针头过滤器过滤除菌，最终得到的桑叶液浓度为100 mg/mL，依次两倍梯度稀释至50、25、12.5 mg/mL。

1.3.2 细胞培养实验中HUVEC-2C用配制好的DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）进行培养，用含0.25%胰蛋白酶（0.02%EDTA）消化传代。二氧化碳培养箱环境设置为5%CO2，37℃。

1.3.3 增殖实验取对数生长期HUVEC-2C，进行消化、计数，控制细胞数量至5×104个/mL。在96孔板中设实验组（100、50、25、12.5 mg/mL）、阳性对照组、阴性对照组，每组设3个复孔，在实验组和阳性对照组中分别加入每孔100 μL的细胞悬液，阴性对照组加入100 μL培养基。在96板内培养HUVEC-2C 8 h直至细胞完全贴壁。在实验组中分别加入10 μL不同浓度桑叶制备液（100、50、25、12.5 mg/mL），阳性对照组、阴性对照组加入10 μL无血清的培养基。培养24 h之后将96孔板置于倒置显微镜下观察，发现细胞无异常生长情况，再在每孔中加入10 μL CCK-8检测试剂，1 h后用酶标仪在单波长450 nm处检测OD值。OD值与细胞密度成正比，OD值越大说明细胞密度越大，反之则越小。

1.3.4 迁移实验取对数生长期HUVEC-2C，进行消化、重悬后计数，调整细胞数量至1×106/mL。在Transwell转移小室的上室每孔加入200 μL细胞悬液，下室加600 μL无血清DMEM培养基。细胞培养8 h后，在实验组的下室加100 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液，对照组加100 μL无血清DMEM培养基，每组设3个复孔。将Transwell转移小室置于5% CO2，37℃二氧化碳培养箱中培养8 h后，用PBS清洗小室内侧，棉球擦去上室内侧中的细胞。小室外侧细胞用无水酒精固定30 min，结晶紫染色30 min。洗净后置于倒置生物显微镜下观察、拍照并分析。

1.3.5 管腔形成实验用每孔100 μL的Matrigel包被24孔板，室温下放置30 min使Matrigel凝固。取出对数生长期的HUVEC-2C，消化、重悬后计数，调整细胞数量至5×105/mL。实验组和对照组每孔接种500 μL细胞悬液。此外，对照组不加桑叶浸出液，实验组加50 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液，每组设置3个复孔。将24孔板放入5%CO2，37℃培养箱中培养，8 h后置于倒置生物显微镜下观察，随机选3个视野拍照。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。其中细胞增殖的抑制率（%）=1-实验组/对照组×100%。

2 结果

2.1 桑叶有效成分对HUVECs的增殖影响

结果显示，通过酶标仪检测实验组（100、50、25、12.5 mg/mL）得到的OD值分别为（0.093±0.010）、（0.124± 0.005）、（0.132±0.002）、（0.144±0.002），而阳性对照组的OD值则为（0.149±0.007）。实验组（100、50、25 mg/mL）显著低于阳性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示桑叶液对HUVEC的增殖抑制作用显著，且当桑叶液浓度达到100 mg/mL时效果更为明显（P＜0.01）。当浓度为100 mg/mL的桑叶液时细胞增殖抑制率可达到37.6%。

2.2 桑叶浸出液对HUVECs迁移的影响

如图1所示，其中阴影部分为被染色的内皮细胞，透明小圆圈是聚碳酸酯膜上的小孔。活细胞可以通过小孔往下室迁移，迁移的内皮细胞大部分贴于上室底面外侧。本实验对迁移至上室底面外侧的内皮细胞进行固定染色，通过对比实验组与对照组染色细胞数目的多少，判断桑叶浸出液对细胞迁移作用影响。经结晶紫染色后可以看出，实验组迁移至上室底面细胞的密度小于对照组的细胞密度，即由于桑叶液的影响，内皮细胞迁移至Transwell小室膜下的数量受到抑制。

2.3 桑叶液对HUVECs管腔形成的影响

如图2所示，按照预期，对照组形成了典型的细胞网络，内皮细胞之间排列有序，组成一个个环状管腔结构；而实验组中则没有形成完整的环状结构，左下角似乎形成了半个环，但是内皮细胞排列不似对照组那么紧密有序，且细胞形态不好，即受到桑叶液的影响，内皮细胞未能在基质胶模型上形成比较完整环状结构。

图1 桑叶液对内皮细胞系HUVEC-2C迁移的影响

图2 桑叶液对内皮细胞管腔形成的影响

3 讨论

正常环境下，血管生成是一个高度有序的过程，只有生长组织有所需求时，才会诱导单层静态内皮细胞分化及血管网络伸展。而肿瘤细胞可以通过模拟正常血管生成过程形成自身血供。肿瘤血管生成主要是通过分泌促血管生长因子，诱导内皮细胞异常增殖、迁移和形成管腔[16]。

桑叶液具有抑制内皮细胞系增殖的能力，抑制作用随着浓度的增长而增强。通过观察Transwell小室，与对照组相比添加了桑叶液的内皮细胞系，其迁移能力受到一定的制约作用。Matrigel实验中，与未加入桑叶液的内皮细胞系所形成的较完整的环状结构相比，加入桑叶液的内皮细胞系在管腔形成方面受到明显的抑制作用。实验表明，桑叶液通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，对肿瘤血管的生成具有抑制作用，从而为其制约肿瘤血管生成、切断营养与氧气供给和废弃物排泄通道、促使肿瘤细胞凋亡提供有力佐证。本研究为桑叶在肿瘤早期预防和治疗中的应用提供了实验依据，使肿瘤早期防治和低成本治疗成为可能。

关于本研究只进行了大量的定性实验，得出桑叶具有抑制血管生成的功效，具体程度尚不明确，且桑叶中的有效组分未知，在之后的研究中将就以上两个方面进一步给予探讨。

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Inhibitory effect of mulberry leaf on tumor angiogenesis

WANG Zhixiong1,2GAO Jianwen1MIAO Weiwei1,2
1.University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai200093,China;2.Medical Engineering Department, Shanghai Medical Instrumentation College,Shanghai200093,China

Objective To study the influence of mulberry on vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming in tumor angiogenesis.Methods The change of HUVEC-2C cell quantity was measured with CCK-8 kit;HUVEC-2C cell migration was studied in Transwell chamber;HUVEC-2C cells were cultured in a 24-pore plate coated with Matrigel to observe its lumen forming.The experiment consisted of experiment group and control group,with three complex holes set for each group.Mulberry leachate was added to the experiment group.The effect of mulberry leaf to tumor angiogenesis was observed.Results Mulberry leachate could inhibit the proliferation ability of HUVEC-2C cell,with the inhibiting effect strengthened as the concentration increases.When the concentration was 100,50,25 mg/mL,the difference between the experiment group and the control group had statistical significance(P＜0.05).When the concentration was 100 mg/mL,the cell proliferation inhibiting ratio of mulberry leachate could reach 37.6%.Observation on Transwell chamber showed the follows:added with mulberry leachate,the HUVEC-2C cells′migration ability was inhibited to some extent compared with the control group.In Matrigel experiment,compared with the comparatively complete cyclic structure formed by HUVEC-2C cells without mulberry leachate,the HUVEC-2C cells added with mulberry leachate were obviously inhibited in term of lumen forming.Conclusion Mulberry leachate has inhibiting effect on tumor angiogenesis by inhibiting vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming.

Mulberry leaf;Tumor angiogenesis;Endothelial cells;Proliferation;Migration;Lumen formation

R282.71

A

1673-7210（2014）09（a）-0022-04

2014-05-21本文编辑：卫轲）