PI-103对人黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制研究

陆茂 叶俊儒 彭科 宋黎

成都医学院第一附属医院皮肤科，四川成都610500

PI-103对人黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制研究

陆茂 叶俊儒 彭科 宋黎

成都医学院第一附属医院皮肤科，四川成都610500

目的观察PI-103在体外对人黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭能力的影响，并探讨可能的作用机制。方法应用MTT法检测不同浓度PI-103对A375细胞增殖的影响，Transwell小室实验检测0.1、0.2 μmol/L PI-103对A375细胞迁移能力和侵袭能力的影响，Western Blot法测定细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表达。结果0.1、0.2 μmol/L PI-103对A375细胞增殖的抑制作用不明显（P＞0.05）；在浓度高于0.4 μmol/L时，PI-103能够明显抑制A375细胞的增殖（P＜0.05）。0.1 μmol/L PI-103作用后，迁移实验和运动实验穿膜细胞数分别为（91.73±13.80）、（63.67±8.54），与对照组比较明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；0.2 μmol/L PI-103作用后，迁移实验和运动实验穿膜细胞数分别为（64.07±9.22）、（34.80±7.89），与对照组比较明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，A375细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论PI-103可通过下调MMP-2、MMP-9的表达抑制A375细胞迁移和侵袭，为其应用于抗恶性黑素瘤转移治疗提供了实验依据。

PI-103；黑色素瘤；迁移；侵袭

恶性黑素瘤是一种起源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤，易转移是其死亡率高的主要原因。黑色素瘤细胞的侵袭转移与信号转导通路的异常激活密切相关，在有关信号转导通路抑制剂中，筛选出高效、低毒的抗黑色素瘤细胞转移药物已成为其研究重要的发展趋势。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与其上游的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（PKB，又称Akt）构成了PI3K/Akt/mTOR信号转导通路。笔者前期及既往其他研究结果显示，PI3K/Akt/mTOR信号通路与黑素细胞的增殖和转移密切相关[1-2]。PI-103是PI3K和mTOR的双重抑制剂，已有研究报道，PI-103在较低浓度下就能导致黑色素瘤细胞周期阻滞，从而抑制其增殖并诱导凋亡[3]，但有关PI-103对黑色素瘤细胞迁移和侵袭的影响国内外鲜见报道。本研究旨在观察PI-103在体外对人黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭能力的影响，并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

PI-103（纯度99.59%）购自美国MCE公司；人黑色素瘤A375细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所；RPMI1640培养液购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国Sigma公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Millicell悬挂式Transwell小室（孔径8 μm）购自美国Millipore公司；Matrigel购自美国BD公司；鼠抗人基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）、MMP-9单抗、碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将A375细胞置于37℃、5%CO2的孵箱中常规培养，培养液为含10%FBS的RPMI1640。每隔48 h换液1次，以1∶3的比例传代。

1.2.2 MTT法检测PI-103对A375细胞增殖的影响取对数生长期A375细胞，调整细胞密度为1×105/mL，接种于48孔板，200 μL/孔。培养24 h后吸除培养液，每孔分别加入200 μL不同浓度的PI-103（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L），每组设5个复孔，同时设空白对照组，对照组加入等量不含PI-103的培养液。24 h后加入20 μL MTT（5 mg/mL），37℃作用4 h后加150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪测490 nm处吸光度（OD）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1-实验组OD/对照组OD）×100%。

1.2.3 Transwell迁移实验检测PI-103对A375细胞迁移力的影响取对数生长期A375细胞以1× 105/mL细胞悬液接种于24孔板，24 h后加入不同浓度的PI-103（终浓度0.1、0.2 μmol/L），设空白对照组，对照组加入等量不含PI-103的培养液，48 h后收集细胞。各组细胞消化、离心后用无血清RPMI1640培养液重悬，调整细胞密度至1×106/mL。将Transwell小室置入24孔板，上室加入200 μL无血清RPMI1640培养液，37℃放置1 h，吸除小室内培养液，上室加入200 μL各组细胞重悬液，下室加500 μL含10%FBS的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2孵育24 h后取出小室，棉签擦去滤膜上层细胞，PBS清洗滤膜，4%的多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min。400倍显微镜下随机计数不重叠5个视野的穿膜细胞数，计算平均值。实验重复3次，每组设3个复孔。

1.2.4 Transwell侵袭实验检测PI-103对A375细胞侵袭力的影响4℃溶解Matrigel过夜，用预冷的无血清培养液以1∶8稀释Matrigel，取50 μL均匀涂于Transwell小室上室的聚碳酸酯膜上，37℃放置30 min，使Matrigel聚合成凝胶，后续同迁移实验。细胞接种密度为2×105/mL。

1.2.5 Western Blot法测定PI-103对A375细胞MMP-2、MMP-9表达的影响同“1.2.3”项下操作收集细胞，加入细胞裂解液，离心提取蛋白质定量，进行SDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭，加入鼠抗人MMP-2、MMP-9单抗作一抗，4℃过夜，TBST洗膜，用碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG作为二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL进行曝光，洗片后用图像分析系统进行吸光度扫描，以GAPDH作为内参，用各蛋白吸光度值/内参吸光度值进行比较。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PI-103对A375细胞增殖的影响

0.1、0.2 μmol/L PI-103对A375细胞增殖的抑制作用不明显，与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；在浓度高于0.4 μmol/L时，PI-103能够明显抑制A375细胞的增殖，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。为了排除PI-103抑制A375细胞增殖作用对迁移和侵袭的影响，本研究选择低于0.4 μmol/L的浓度进行后续实验。

2.2 PI-103对A375细胞迁移力和侵袭力的影响

0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，与对照组比较，Transwell迁移实验和侵袭实验穿膜细胞数均明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 PI-103对A375细胞增殖的影响（x±s）

表2 PI-103对A375细胞迁移力和侵袭力的影响（x±s）

2.3 PI-103对A375细胞MMP-2、MMP-9表达的影响

与对照组比较，0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，A375细胞中MMP-2、MMP-9表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表3。

图1 PI-103作用后A375细胞中MMP-2、MMP-9表达情况

表3PI-103对A375细胞MMP-2、MMP-9表达的影响（%，x±s）

3 讨论

PI3K/Akt/mTOR信号通路在多种恶性肿瘤中高度激活，调控肿瘤细胞增殖、生长、转移等过程，已成为肿瘤治疗的一个重要靶点[4]。有研究表明，单纯阻断PI3K/Akt通路，并不能有效抑制下游mTOR通路，因为mTOR信号通路的激活除了来自PI3K/Akt途径，还可来自其他信号通路，而单纯抑制mTOR通路，却可能通过负反馈活化PI3K激酶。所以，同时使用PI3K和mTOR的双重抑制剂更能有效抑制肿瘤的生长和转移[5]。PI-103是人工合成的脂质激酶家族中的一种小分子药物，能同时抑制PI3K和mTOR，尤其是PI3Kα、mTORC1和mTORC2，而且PI-103有良好的药物稳定性，毒副作用小[6-7]。已有研究发现，PI-103可抑制结直肠癌细胞[7]、乳腺癌细胞[8]、神经母细胞瘤细胞[9]、肝星状细胞细胞[10]、肾癌细胞[11]的增殖，还可抑制结直肠癌细胞[12]、神经胶质瘤细胞[13]的转移，同时可增强顺铂[6]、厄洛替尼[14]等化疗药物抗肿瘤效果。

Transwell小室能够较为理想地模拟和反映肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，是检测肿瘤细胞体外迁移力和侵袭力最经典的实验方法。本实验旨在研究PI-103对A375细胞迁移和侵袭的影响，若出现细胞活力下降则影响结果的判断，因此本研究选择了PI-103对A375细胞活力影响小的浓度（低于0.4 μmol/L）来进行Transwell体外迁移和侵袭实验。结果显示，经0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后穿过小室的A375细胞数量减少，提示PI-103可以降低A375细胞的迁移力和侵袭力。

肿瘤细胞的迁移和侵袭是一个多步骤、多阶段的复杂过程，细胞基底膜及细胞外基质的降解突破是其中重要的环节之一。MMPs是基底膜及细胞外基质降解的主要蛋白水解酶，其中MMP-2、MMP-9是MMPs家族中的重要成员，能有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原和层粘连蛋白，其表达水平与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关[15]。有研究表明，PI3K可通过活化Akt激活黑色素瘤细胞磷脂蛋白2，进而促进MMP-2的表达[16]。大量研究证实，黑色素瘤细胞MMP-2、MMP-9的表达水平与其侵袭力呈正相关，抑制MMP-2、MMP-9的表达能抑制黑素瘤细胞的侵袭和转移[17-18]。本研究显示，PI-103在体外可抑制A375细胞MMP-2、MMP-9的表达，由此推测PI-103可能是通过竞争性抑制黑色素瘤细胞PI3K/mTOR，阻断Pl3K/Akt/mTOR信号通路，下调MMP-2、MMP-9的表达，进而抑制其迁移和侵袭。

综上所述，PI3K/mTOR双重抑制剂PI-103在体外可抑制A375细胞迁移和侵袭，其机制可能与下调MMP-2、MMP-9的表达有关，这显示了它在恶性黑素瘤治疗中的潜在应用价值，为其应用于抗恶性黑素瘤转移治疗提供了初步的实验依据。

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Effects of PI-103 on migratory and invasive abilities of human melanoma A375 cells and its mechanism

LU MaoYE JunruPENG KeSONG Li
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610500,China

Objective To investigate the effects of PI-103 on the migratory and invasive abilities of human melanoma A375 cells in vitro and its mechanism.Methods The effects of PI-103 with different concentration on the proliferation of A375 cells were detected by MTT assay.The effects of PI-103 at 0.1,0.2 μmol/L concentration on the migratory and invasive abilities of A375 cells were detected by transwell chamber assay.The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells were determined by Western Blot.Results The inhibition effects on the proliferation of A375 cells treated with PI-103 at 0.1,0.2 μmol/L concentration were not significant(P＞0.05).The proliferation of A375 cells treated with PI-103 at the concentration higher than 0.4 μmol/L was significantly inhibited(P＜0.05).The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.1 μmol/L concentration were (91.73±13.80),(63.67±8.54)respectively,which were significantly decreased compared with control group(P＜0.05). The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.2 μmol/L concentration were(64.07±9.22),(34.80±7.89)respectively,which were significantly decreased compared with control group(P＜0.05).The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells treated with PI-103 at 0.1,0.2 μmol/L concentration were significantly decreased compared with control group(P＜0.05).Conclusion PI-103 can inhibit the migration and invasion of A375 cells by down-regulation of the expressions of MMP-2 and MMP-9,which provide the experimental basis for the prevention of melanoma metastasis.

PI-103;Melanoma;Migration;Invasion

R739.5

A

1673-7210（2014）09（a）-0014-04

2014-05-23本文编辑：程铭）

四川省卫生厅立项科研课题（编号110466）。

陆茂（1975-），男，硕士，副主任医师；研究方向：皮肤组织病理学。