巴桑母酥油丸对放射线-化学复合损伤小鼠造血干细胞移植后重建造血能力的影响

降央泽仁 黄茜 黄晓芹

1.成都中医药大学基础医学院，四川成都611137；2.成都中医药大学民族医药学院，四川成都611137

巴桑母酥油丸对放射线-化学复合损伤小鼠造血干细胞移植后重建造血能力的影响

降央泽仁1黄茜1黄晓芹2

1.成都中医药大学基础医学院，四川成都611137；2.成都中医药大学民族医药学院，四川成都611137

目的研究藏药巴桑母酥油丸对放射线.化学复合损伤后机体骨髓造血干细胞功能的影响，探究其“补益”作用机制。方法将经60Co γ射线照射+环磷酰胺腹腔注射方法得到的放射线.化学复合损伤小鼠分为巴桑母酥油丸组、生理盐水组、空白组，分别灌胃巴桑母酥油丸、生理盐水及自然恢复14 d后，将其骨髓作为供体移植给受致死剂量γ射线照射的同种受体小鼠，再检测受体小鼠外源性脾集落、骨髓造血祖细胞集落产率、骨髓细胞造血干细胞抗原.1(Sca.1)阳性细胞率，并与灌胃。结果巴桑母酥油丸组的外源性脾集落、骨髓早期红系祖细胞集落(BFU.E)、粒.巨噬系祖细胞集落(CFU.GM)产率均显著高于空白组和生理盐水组(P＜0.05)，而晚期红系祖细胞集落(CFU.E)、巨核系祖细胞集落(CFU.Meg)、骨髓细胞Sca.1+细胞率并不高于自然恢复的空白组(P＞0.05)。结论巴桑母酥油丸可以提高放射线.化学复合损伤小鼠骨髓造血干细胞移植后造血重建能力，提示巴桑母酥油丸可经改善骨髓造血干细胞功能发挥其对放射线.化学复合损伤机体“补益”作用。

巴桑母酥油丸；放-化疗；造血干细胞；骨髓移植；造血重建；补益

造血功能抑制(骨髓抑制)是放、化疗最严重、最根本的毒副作用，其降低了患者生存质量，并直接影响到治疗效果和生存率。笔者前期工作显示，藏医经典滋补方“巴桑母酥油丸”可促进放射线.化学复合损伤小鼠外周血象的恢复［1］。本实验拟通过同种异体小鼠骨髓移植方法，比较研究灌胃巴桑母酥油丸、生理盐水及自然恢复的放射线.化学复合损伤小鼠骨髓造血干细胞在正常受体小鼠体内重建造血的能力，以探究巴桑母酥油丸对放射线.化学复合损伤小鼠造血干细胞的功能干预作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体级8～12周龄雄性C57BL6J小鼠60只，动物许可证号SCXK(川)2009.09，购买于四川大学实验动物中心，18～22 g。

1.2 药品和试剂

巴桑母酥油丸(Basangmu Suyou Wan，西藏藏医学院藏药有限公司，批号：101201)，生理盐水稀释溶解至所需浓度，4℃贮存备用，用前加热混匀；PE标记的大鼠抗小鼠造血干细胞抗原.1抗体［PE anti.mouse Ly.6A/E(Sca.1)，美国BioLegend，批号：108107］；同型对照：Rat IgG2a，κ(美国BioLegend，批号：400507)；

1.3 仪器设备

60Co γ源(四川省农业科学院生物技术核技术研究所辐照中心)；MCD.15A.CO2培养箱(日本SANYO公司)；CX.10.倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；ELITE ESP.流式细胞仪(美国BECKMAN COULTER)。

1.4 实验方法

1.4.1 放射线-化学复合损伤小鼠模型建立及分组采用本室60Co γ射线照射+环磷酰胺腹腔注射的常规方法［2］制造放射线.化学复合损伤(以下简称放.化复合损伤)小鼠模型30只，于造模完成后第2天随机分为巴桑母酥油丸组、生理盐水组、空白组，每组10只(供体小鼠)，巴桑母酥油丸组小鼠每日灌胃1.5 g/kg的药物(与前期研究一致)，生理盐水组灌胃同体积生理盐水(0.1 mL)，1次/d，持续14 d，最后一次灌胃24 h后处死小鼠，无菌条件下分离骨髓细胞(BMC)进行后续操作。自然恢复的空白组不予以灌胃，同等条件下饲养14 d后分离骨髓细胞进行后续实验。

1.4.2 骨髓移植及脾集落分析30只正常小鼠(受体小鼠)，经60Co γ射线9 Gy照射后，经尾静脉注入“1.4.1”项下分离的各组骨髓细胞(5×104个/只)，注射9 d后杀鼠分离脾脏，用Bousin氏液固定24 h后用氨酒精脱色，肉眼计数脾集落数。

二是次要关系。旅游危机事件网络舆情系统中的主客系统与外围因素之间的互动形成了除主客关系外的次要关系。旅游危机事件网络舆情系统中的外围因素虽然没有显著作用于系统内的舆情主体、舆情客体以及传播媒介，但起到了重要的环境变量的作用，从而形成了外围因素与主客系统之间的互动关系，构成了旅游危机事件网络舆情系统中的次要关系。由政治、经济、文化、制度以及技术等因素共同形成的环境从宏观层面影响着旅游危机事件网络舆情的发展与演化，因此，不能忽略外围环境因素在旅游危机事件网络舆情系统中发挥的作用。主要关系与次要关系都是客观存在的，且二者相辅相成，共同构成旅游危机事件网络舆情系统。

1.4.3 骨髓祖细胞集落产率分析无菌分离受体小鼠一侧股骨骨髓细胞，常规进行体外半固体体骨髓早期红系祖细胞集落(BFU.E)、晚期红系祖细胞集落(CFU.E)、粒.巨噬系祖细胞集落(CFU.GM)、巨核系祖细胞集落(CFU.Meg)培养计数。

1.4.4 骨髓Sca-1免疫表型阳性（Sca-1+）细胞数检测用磷酸缓冲液(PBS)洗涤分离的受体小鼠另一侧股骨骨髓细胞，调骨髓细胞为≥1×106个/mL，取100 μL样品加入上机试管底部，加入单克隆抗体20 μL，混匀，室温避光孵育20 min，加入500 μL红细胞裂解液充分混匀，室温静置20 min，加入500 μL PBS液，充分混匀，上机检测(先做同型对照，设立阴阳性分界线后再做Sca.1检测)，以散点图显示阳性细胞百分比。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用方差分析。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1 巴桑母酥油丸对放-化复合损伤小鼠造血干细胞移植后形成脾集落和骨髓祖细胞集落能力的影响（±s，n=10）

表1 巴桑母酥油丸对放-化复合损伤小鼠造血干细胞移植后形成脾集落和骨髓祖细胞集落能力的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，☆P＜0.05；与生理盐水组比较，★P＜0.05

组别脾集落(个/脾) B F U . E ( / 5 × 410B M C ) C F U . E ( / 5 × 410B M C ) C F U . G M ( / 5 × 410B M C ) C F U . M e g ( / 5 × 410B M C )空白组生理盐水组巴桑母酥油丸组1 7 . 2 0 ± 2 . 2 5 1 5 . 5 0 ± 3 . 0 3 2 0 . 1 0 ± 2 . 8 0☆★1 4 . 0 0 ± 1 . 7 9 1 5 . 0 0 ± 2 . 7 6 1 8 . 6 7 ± 3 . 2 7☆★2 4 . 3 3 ± 4 . 6 3 2 1 . 3 5 ± 3 . 2 6 2 8 . 6 7 ± 3 . 2 7★2 6 . 0 0 ± 3 . 5 8 2 4 . 3 3 ± 4 . 9 7 3 2 . 0 0 ± 2 . 8 3☆★5 . 3 1 ± 0 . 8 2 4 . 2 3 ± 1 . 0 3 6 . 3 4 ± 1 . 5 0★

2.1 巴桑母酥油丸对放-化复合损伤小鼠造血干细胞移植后形成脾集落能力的影响

各组供体小鼠骨髓细胞移植后，受体小鼠外源性脾集落产率见表1。结果显示，移植巴桑母酥油丸组、生理盐水组、空白组的小鼠脾集落产率分别为(20.10± 2.80)，(15.50±3.03)，(17.20±2.25)个/脾，巴桑母酥油丸组显著高于其余两组(P＜0.05)。

2.2 巴桑母酥油丸对放-化复合损伤小鼠造血干细胞移植后形成骨髓祖细胞集落能力的影响

2.3 巴桑母酥油丸对放-化复合损伤小鼠造血干细胞移植后出现骨髓Sca-1+细胞数的影响

各组供体小鼠骨髓细胞移植后，受体小鼠骨髓Sca.1+细胞数检测结果见图1～2。结果显示，接受各供体组小鼠骨髓移植的受体小鼠，其骨髓中Sca.1+细胞比例比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1各组受体小鼠骨髓细胞Sca-1+细胞率检测

图2 巴桑母酥油丸对受体小鼠骨髓Sca-1+细胞率的影响

3 讨论

在血细胞的发生过程中，造血干细胞与造血微环境间的关系就似“种子”和“土壤”的关系［3.4］。受致死剂量γ射线辐射后，受体的造血功能被摧毁［5］，此时接受骨髓移植后，供体的造血干细胞在受体体内经过归巢、增殖、分化，从而重建受体的造血功能，在受体机体状况完全一致的情况下，重建造血的结果主要取决于所接受的造血干细胞［6］，检测的造血相关指标可以反映出不同供体间造血干细胞的功能差异。

造血干细胞通过不对称分裂的形式，即分裂后形成一个保留干细胞全部特点的子代细胞和一个可以进一步分裂分化成为其他后续造血细胞的子代细胞，维持自己数量的相对恒定(自我更新)，这是其重建受体永久性造血的基础，也是制约其数量扩增而功能不分化的原因［7］。Sca.1+被认为是小鼠造血干细胞的重要标志物［8.9］，同时造血干细胞的自我更新以及定向分化，尤其是向巨核系分化、血小板形成需要Sca.1抗原的参与［10］。实验中灌胃巴桑母酥油丸提高了放化复合损伤小鼠造血干细胞在受体小鼠脾脏分裂、分化为脾集落的能力和在骨髓向粒.巨噬系、红系造血定向分化的能力，但对骨髓Sca.1+细胞率的改变和造血干细胞向巨核系分化没有促进作用，提示巴桑母酥油丸具有促进放化复合损伤小鼠造血干细胞在受体体内重建红系、粒.巨噬系造血的能力。由于除骨髓外，脾脏也是小鼠重要的造血器官［11］，并是骨髓移植后巨核系造血的重要场所［12］，巴桑母酥油丸可否增加脾脏Sca.1+细胞数或促进脾脏造血干细胞向巨核系方向分化有待进一步研究。

［1］黄晓芹，降央泽仁，冯冠荣，等.藏药巴桑母酥油丸对放、化复合损伤“血虚证”小鼠造血功能干预初探［J］.中药与临床，2010，1(2)：38.39.

［2］黄晓芹，降央泽仁，祝彼得.放化复合损伤至血虚证小鼠肾脏EPO、脾脏EPO.R、骨髓GM.CSFmRNA表达改变［J］.成都中医药大学学报，2009，32(3)：56.60.

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［12］成令忠，钟翠平，蔡文琴.现代组织学［M］.上海：上海科学技术文献出版社，2003：309.

Effect of Basangmu Suyou Wan on hematopoietic reconstitution ability after hematopoietic stem cell transplantation in combined radiation and chemical injured mice

Jiangyangzeren1HUANG Qian1HUANG Xiaoqin21.Preclinical School,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Province,Chengdu611137,China; 2.Ethnomedicine School,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Province,Chengdu611137, China

Objective To research the effect of the traditional Tibetan drug,Basangmu Suyou Wan,on the function of hematopoietic stem cells in bone marrow after combined radiation and chemical injury,and explore the tonic mechanism.Methods Combined radiation and chemical injured mice,which received60Co γ.irradiation and intraperitoneal injection of cyclophosphamide,were randomly divided into three groups.The Basangmu Suyou Wan group and saline group were gavaged with Basangmu Suyou Wan and saline for 14 days,respectively.Non.gavaged mice were used as blank control.Bone marrow cells from all mice as donors were transplanted into recipient mice exposed to a lethal dose of γ.irradiation.The spleen colony forming unit（CFU.S）,bone marrow hematopoietic progenitor colony proportion and hematopoietic stem antigen.1（Sca.1）positive cell proportion of recipient mice were tested after transplantation. Results In recipient mice which received transplantation from Basangmu Suyou Wan group,the CFU.S,bone marrow earlier period erythropoieted progenitor colony（BFU.E）and granulocyte.macrophage colony forming unit（CFU.GM）reached levels significantly higher than mice given donations from blank group and saline group（P＜0.05）,while the later period of erythropoited progenitor colony（CFU.E）,megakaryocyte colony forming unit（CFU.Meg）and Sca.1+cell proportion were not more than the blank group（P＞0.05）.Conclusion Basangmu Suyou Wan enhances hematopoietic reconstitution ability after hematopoietic stem cell transplantation in combined radiation and chemical injured mice, thus indicating it can exert tonic effect in the combined radiation and chemical injured body by improving the hematopoietic stem cell function in bone marrow.

Basangmu Suyou Wan;Radiochemotherapy;Hematopoietic stem cell;Bone marrow transplantation; Hematopoietic reconstitution;Tonic

R285.5

A

1673-7210（2014）02（a）-0038-03

2013.11.01本文编辑：卫轲)

国家自然科学基金资助项目(编号81072893)。

黄晓芹，博士，教授，主要从事中(藏)西医结合基础研究。