绞股蓝皂苷对人衰老皮肤成纤维细胞抗氧化酶活性的影响

丛 敬 郭 丽丁晓慧 吴景东 宫 倩

1.沈阳医学院组胚教研室，辽宁沈阳110034；2.沈阳医学院中心实验室，辽宁沈阳110034；3.辽宁中医药大学学生处，辽宁沈阳110031；4.沈阳医学院基础医学院，辽宁沈阳110034

绞股蓝皂苷对人衰老皮肤成纤维细胞抗氧化酶活性的影响

丛 敬1郭 丽2丁晓慧1吴景东3宫 倩4

1.沈阳医学院组胚教研室，辽宁沈阳110034；2.沈阳医学院中心实验室，辽宁沈阳110034；3.辽宁中医药大学学生处，辽宁沈阳110031；4.沈阳医学院基础医学院，辽宁沈阳110034

目的在细胞水平研究绞股蓝皂苷对抗氧化酶活性的影响。方法原代培养并建立人衰老皮肤成纤维细胞系，0、5、10、15 mg/L绞股蓝皂苷处理细胞，24、72、96 h后，四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖；72 h后检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果药物作用24、72 h后，10、15mg/L绞股蓝皂苷可以促进人衰老成纤维细胞增殖，增殖效应呈时间和浓度依赖（P＜0.05）。与0 mg/L比较，10、15 mg/L绞股蓝皂苷可以增强细胞SOD、CAT、GSH-Px活性（P＜0.05），且与10mg/L绞股蓝皂苷比较，15 mg/L绞股蓝皂苷能够显著提高SOD和GSH-Px活性（P＜0.05）。结论绞股蓝皂苷可以通过提高SOD、CAT、GSH-Px活性，削弱氧化应激反应对细胞的损伤，使细胞增殖能力增强，延缓细胞衰老。

绞股蓝皂苷；成纤维细胞；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；谷胱甘肽过氧化物酶；衰老皮肤

衰老是一种多环节的生物学过程，是机体在退化时期功能下降和紊乱的综合表现，是体内各脏器细胞功能减低的现象[1]。成纤维细胞对于胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的合成下降是皮肤衰老的重要特征[2]。绞股蓝是葫芦科草质藤本植物，是五加科之外唯一含有与人参皂苷相似结构皂苷的植物，其皂苷成分具有保护心脑血管、抗脑缺氧、抗肿瘤及抗衰老等药理作用，并在治疗高血脂症、血管性痴呆、消化道溃疡以及中风等方面取得了一定的疗效，因此引起国内外众多学者的重视[3]。本实验研究绞股蓝皂苷对于人衰老皮肤成纤维细胞多种抗氧化酶活性的影响，浅探其在细胞水平的抗衰老作用和机制，为绞股蓝的进一步临床应用及市场开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

皮肤标本3例，取自施行眼袋切除术和倒睫矫正术的老年女性眼睑周围的正常皮肤，年龄55～60岁，由中国医科大学第四附属医院眼科提供。绞股蓝皂苷，成都曼思特生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清，美国GIBCO公司；胰蛋白酶，美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液，中国北京中杉金桥生物技术有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，南京建成生物医学工程研究所；其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 建立细胞系及分组皮肤标本用胶原酶消化，置37℃，5%CO2培养箱中植块法原代培养，建立衰老的人皮肤成纤维细胞系。实验选用第3～6代细胞，分为0、5、10、15mg/L绞股蓝皂苷组，即A、B、C、D组，给予对应浓度的绞股蓝皂苷处理细胞，24、72、96 h后，四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖情况；72 h后，检测SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.2.2 制备绞股蓝皂苷取0.1 g绞股蓝皂苷溶于1mL二甲基亚砜（DMSO），配成0.1mg/L的贮存液，DMEM培养液倍比稀释，使其终浓度分别为5、10、15mg/L。1.2.3 MTT法检测细胞增殖制备单细胞悬液，接种于96孔板上，分别加入绞股蓝皂苷0、5、10、15μg/mL，同时根据DMSO的浓度做相应溶剂对照，每组细胞的药物浓度孔及相应溶剂对照孔均做5复孔。另做1孔不加细胞，只加培养液和绞股蓝皂苷。共做3块培养板。培养24、72、96 h各取出1块培养板，MTT法检测各孔吸光度值[4]。

1.2.4 细胞抗氧化酶活性测定分别收集各组细胞，超声破碎，离心取上清液，按试剂盒说明书中的方法测定SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，方差齐时，行单因素方差分析，LSD-t法进行多组间两两比较；方差不齐时，采用非参数分析进行多组间比较，Dunnett T3法进行多组间两两比较[5]。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绞股蓝皂苷浓度和作用时间对衰老成纤维细胞增殖的影响

加入不同浓度绞股蓝皂苷，培养24、72、96 h可见，各组细胞均继续生长，其中24 h及72 h细胞生长较快，至96 h细胞生长放缓。培养24、72 h时，与A组比较，B组无促进细胞增殖作用，C组、D组表现为增殖促进（P＜0.05），且D组的增殖促进作用更强（P＜0.05）。培养96 h时，呈饱和状态，药物浓度对细胞增殖作用组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 绞股蓝皂苷浓度和作用时间对衰老成纤维细胞增殖的影响

2.2 浓度对衰老成纤维细胞抗氧化酶活性的影响

SOD活性检测结果显示，与A组比较，B组差异无统计学意义（P＞0.05）；C组、D组细胞SOD活性提升（P＜0.05），且D组作用更强（P＜0.05）。CAT活性检测结果显示，与A组比较，B组差异无统计学意义（P＞0.05）；C组、D组细胞CAT活性增强（P＜0.05）。GSH-Px活性检测结果显示，与A组比较，B组差异无统计学意义（P＞0.05）；C组、D组细胞GSH-Px活性均有不同程度增强（P＜0.05），且D组增强更显著（P＜0.05）。提示绞股蓝皂苷可提高人衰老皮肤成纤维细胞SOD、CAT、GSH-Px活性，且呈浓度依赖。见表1。

表1 浓度对衰老成纤维细胞抗氧化酶活性的影响（kU/L，s）

表1 浓度对衰老成纤维细胞抗氧化酶活性的影响（kU/L，s）

注：与A组比较，△P＜0.05；与C组比较，#P＜0.05；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶

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3 讨论

衰老的自由基学说认为皮肤细胞的内源性衰老和外源性衰老有着共同的分子机制，即均遭受活性氧（ROS）所致的氧化应激，并引发一系列后续效应。ROS不仅能直接损害线粒体导致能量产生不足和钙平衡紊乱，还能直接损伤细胞膜脂质、核酸、酶和受体等生物大分子，导致生物膜脂质过氧化、基因稳态失衡或基因突变，蛋白质羟基化、酶失活；与此同时，清除自由基的抗氧化酶的活性不断下降使体内的自由基物质过剩，最终导致衰老[6-7]。生物体内具有多种抗氧化酶体系。SOD具有清除超氧阴离子、减轻过氧化损害、保护细胞免受自由基伤害的作用[8]。CAT可以利用H2O2氧化各种底物，使有毒物质失活，同时催化H2O2分解为H2O与O2，是生物防御系统的关键酶之一[9]。GSH-Px是一种重要的过氧化物分解酶，它能催化谷胱甘肽变为氧化型谷胱甘肽，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。在正常情况下，机体代谢过程中产生的超氧阴离子被细胞的SOD歧化为H2O2，后者再由CAT和GSH-Px催化降解[10]。

成纤维细胞合成分泌的纤维蛋白参与构成了真皮层中细胞成分之外的所有组分。皮肤衰老的种种临床表现都与成纤维细胞数量减少、合成功能下降或异常有关。有研究显示，成纤维细胞从“年轻”向“老化”发展的进程中，伴随着DNA和蛋白质的氧化损伤，细胞氧化还原状态的改变，细胞内ROS水平逐渐增高[11]，抗氧化酶活性降低[12]。动物实验[13-14]表明，灌胃（0.8 m L/t）配以外用（5 g/t）绞股蓝提取液可以增强自然衰老小鼠皮肤组织内SOD、CAT的活性。绞股蓝皂苷是绞股蓝中提取出来的药效成分。外用1.5%绞股蓝皂苷霜可使光损伤模型小鼠表皮中抗氧化酶活性得到恢复，其抗氧化作用与维生素E霜相似[15]。本文研究结果进一步证实，绞股蓝皂苷可以在细胞水平提高抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性，拮抗ROS对成纤维细胞数量和功能的损伤，促进成纤维细胞增殖，修复甚至提高其合成分泌功能，从而使改善皮肤衰老成为可能，但其具体的分子机制尚需进一步证实。关于人衰老皮肤成纤维细胞的相关研究可以为阐明皮肤衰老的机制，探寻细胞衰老与器官衰老之间的关系提供佐证。

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Effect of gypenosides on antioxidative enzymes of human aged skin fibroblasts

CONG Jing1GUO Li2DING Xiaohui1WU Jingdong3GONG Qian4
1.Department of Histology and Embryology,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110034,China; 2.Central Lab,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110034,China;3.Students Affair Office, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Shenyang 110031,China;4.School of Basic Medicine,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110034,China

Objective To study the effect of gypenosides(Gyp)on the activity of antioxidative enzymes at cellular level. Methods After the primary culture and subculture,human aged skin fibroblastswere incubated with Gyp(0,5,10,15 mg/L)for 24,72 and 96 h respectively.The MTTmethod was used to evaluate the cell proliferation and assay the biologic activities of Gyp in different time and different doses.Relative level of the activity of SOD,CAT and GSH-Px in cellsweremeasured by cytochemistry.Results Aged fibroblasts proliferation could be promoted by Gyp(10,15 mg/L) for 24,72 hours treatment(P＜0.05).The activity of SOD,CAT and GSH-Px increased in both group 10 and 15mg/L Gyp as compared with group 0mg/L(P＜0.05).Compared with 10mg/LGyp group,15 mg/LGyp group showed significantly increased in the activity of SOD and GSH-Px(P＜0.05).Conclusion Gyp protects the aged fibroblasts by weakening oxidative stress,increasing the activity of antioxidative enzymes,and therefore delay the cells ageing.

Gypenosides;Fibroblasts;SOD;CAT;GSH-Px;Aged skin

R-332

A

1673-7210（2014）01（b）-0032-03

2013-11-13本文编辑：程铭）