CHOP/GADD 153在胎儿生长受限患者胎盘组织中的表达及意义

林海英 张彦华 王开明 黄小红

广东省深圳市宝安区妇幼保健院产科，广东深圳518100

CHOP/GADD 153在胎儿生长受限患者胎盘组织中的表达及意义

林海英 张彦华 王开明 黄小红

广东省深圳市宝安区妇幼保健院产科，广东深圳518100

目的探讨内质网应激相关蛋白CHOP/GADD153在胎儿生长受限（FGR）患者胎盘组织中的表达及意义。方法选择2012年7月～2013年5月深圳市宝安区妇幼保健院FGR孕妇46例为FGR组，另选择孕龄正常孕妇34名为对照组。采用免疫组化法检测CHOP/GADD153在各组胎盘组织中的表达，并采用Tunnel法检测各组胎盘组织细胞凋亡率。结果FGR组胎盘组织CHOP/GADD153免疫组化阳性表达率67.8%，明显高于对照组的14.7%，差异有高度统计学意义（χ2=7.57，P＜0.01）；FGR组胎盘组织细胞凋亡率为（37.6±5.3）%，明显高于对照组的（12.3±1.5）%，差异有统计学意义（t=2.342，P＜0.05）。结论内质网应激相关蛋白CHOP/GADD153介导的细胞凋亡与FGR的发生机制有关。

胎儿生长受限；内质网应激；凋亡

胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）是妊娠期常见的并发症之一，其发病率为3%～10%，我国发病率平均6.39%，其围生儿病死率高，近期及远期并发症多，近期不仅影响胎儿的发育，远期也影响儿童期及青春期的体能与智能发育，甚至与成年期一些疾病的发生也存在一定的相关性[1]。其发病机制不明，目前尚处于研究探索之中。本研究通过测定FGR患者胎盘组织中内质网应激相关蛋白CHOP/GADD153的表达及细胞凋亡，探讨内质网应激介导的细胞凋亡与FGR发病的相关性，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年7月～2013年5月深圳市宝安区妇幼保健院FGR孕妇46例为FGR组，另选择孕龄正常孕妇34例为对照组，均为单胎妊娠，已排除胎儿畸形及妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病等妊娠期并发症及合并症。FGR的诊断标准为足月胎儿出生体重＜2500 g，或胎儿体重低于同孕龄平均体重的两个标准差；或低于同孕龄正常体重第10百分位数[2]。FGR组年龄21～37岁，平均（31.4±4.1）岁；分娩孕龄34～39周，平均（36.9±2.6）周；胎次1～4次，平均（1.8± 0.7）次。对照组年龄23～38岁，平均（29.4±3.6）岁；分娩孕龄34～40周，平均（37.5±2.9）周；胎次1～5次，平均（1.9±0.9）次。对照组与FGR组平均年龄、孕龄、胎次一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。待胎盘娩出后，于母面近脐带处，避开钙化点迅速取胎盘组织约1 cm×1 cm×1 cm，置于10%中性福尔马林液中固定，进一步检测CHOP/GADD153的表达及细胞凋亡。本研究已经医院伦理委员会通过，患者知情同意，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化法检测胎盘组织中CHOP/GADD153的表达胎盘组织福尔马林固定，石蜡包埋，制成切片。切片脱蜡、水化，采用胃蛋白酶进行抗原修复，滴加封闭液，37℃湿盒孵育30 min，滴加一抗（Cell Signaling公司，美国，鼠抗人，1∶100），37℃湿盒孵育2 h，TBS-T洗涤5 min×3次，滴加封闭液5 min×3次，滴加二抗（Cell Signaling公司，美国，羊抗鼠IgG，1∶200），37℃湿盒孵育30 min，TBS-T洗涤5min×3次，滴加试剂Tween20，37℃湿盒孵育20 min；加HRP-SA，37℃湿盒孵育30 min，TBS-T洗涤5 min×3次，TBS洗涤5min×2次，二氨基联苯胺（DAB）显色、复染、脱水、透明、封片，显微镜下观察成像。磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。每张切片随机取5个非重叠400倍镜视野，以镜下细胞内出现棕黄色颗粒或团块者为阳性细胞，阳性细胞占50%～100%为强阳性（+++），占25%～＜50%为中度阳性（++），占5%～＜25%为弱阳性（+），占0%～＜5%为阴性（-）。观察各组CHOP/ GADD153表达及阳性细胞的分布情况。免疫组化表达总阳性率=（强阳性+中度阳性+弱阳性）细胞数/细胞总数×100%。

1.2.2 Tunne l法检测胎盘组织细胞凋亡所用试剂为细胞凋亡检测试剂盒，购自武汉博士德生物技术有限公司。胎盘组织福尔马林固定，石蜡包埋，制成切片。切片脱蜡入水。3%H2O2处理10 min，蒸馏水洗涤2 min×3次；proteinase K消化10～15 min，TBS洗2 min×3次；滴加标记缓冲液37℃标记2 h，TBS洗2 min×3次，加封闭液30 min，甩掉封闭液，加生物化抗地高辛抗体，37℃反应30min，TBS洗2 min×3次；加SABC，37℃反应30 min，TBS洗5 min×4次；DAB显色，苏木精轻度复染。脱水、透明、封片，显微镜观察。未凋亡细胞的胞核染成蓝色，凋亡细胞的细胞核呈棕黄色（Tunnel阳性）。随机选取共5个非重叠400倍镜视野，计数凋亡细胞数和总细胞数，细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两独立样本的计量资料采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验及秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化法CHOP/GADD 153在各组胎盘组织的表达

CHOP/GADD153主要表达于胎盘滋养细胞的细胞浆及细胞核中，呈棕黄色颗粒，见图1、2，各组CHOP/GADD153表达强度变化见表1。FGR组胎盘组织CHOP/GADD153免疫组化阳性表达率和阳性级别明显高于正常对照组，两组比较差异有高度统计学意义（χ2=7.57，P＜0.01）。

图1 对照组胎盘组织CHOP阴性表达（400×）

图2 FGR组胎盘组织CHOP阳性表达（400×）

表1 两组胎盘组织中CHOP/GADD153的表达情况（%）

2.2 各组胎盘组织细胞凋亡率

FGR组胎盘组织细胞凋亡率为（37.6±5.3）%，对照组胎盘组织细胞凋亡率为（12.3±1.5）%，FGR组明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（t=2.342，P＜0.05）。见图3、4及表2。

3 讨论

FGR与多种妊娠期合并症、并发症及胎儿先天畸形等因素有关，但仍有约40%的FGR病因至今尚未明确，目前发病机制研究涉及瘦素、胰岛素样生长因子2I（IGF2I）、抗心磷脂抗体、血管内皮生长因子（VEGF）、胎盘生长因子（placenta growth factor，PLGF）等方面[3-6]。

近年来在FGR的发病机制研究中，有关胎盘细胞过度凋亡和凋亡与增殖之间的平衡紊乱日益受到学者的关注[7-9]。本研究发现，FGR胎盘组织细胞凋亡率明显高于正常妊娠组，提示滋养细胞过度凋亡与FGR发病相关，与其他学者研究结论相同，但引起细胞凋亡的途径值得进一步探讨。

细胞凋亡除了死亡受体途径、线粒体途径外，目前较受关注的一种新的诱发凋亡途径是内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途径。内质网是真核细胞中重要的细胞器，是蛋白质翻译、合成和细胞内钙离子的储存场所，其结构和功能的重要性决定了内质网对多种刺激非常敏感，如缺血、缺氧、饥饿、钙离子平衡失调、自由基侵袭及药物等都可以诱发ERS。ERS是应激时发生在细胞中的最初反应，是细胞本身的一种自我保护性机制。但是，反应过强或时间过长的ERS可以引起细胞功能失调，甚至细胞死亡[10-13]。CHOP/GADD153是转录因子家族C/EBP成员之一，在正常生理状态下基本检测不到，但在ERS时，被显著诱导表达，参与调节细胞凋亡[14-15]。

本研究发现，FGR胎盘组织CHOP/GADD153表达明显高于正常妊娠组，提示内质网应激途径介导的细胞凋亡与FGR的发生机制有关。当机体遭遇不良刺激，诱发内质网应激，持久的应激引发细胞凋亡，影响母胎间营养交换，从而导致FGR。

目前FGR的治疗尚无特别有效的方法，理论上营养治疗有利于胎儿生长，但临床通过静脉营养治疗，实际效果并不理想，可能与内质网应激介导的滋养细胞凋亡影响母胎营养交换有关，该研究发现可为FGR的治疗提供新的靶点。

图3 细胞凋亡Tunnel染色阴性对照（400×）

图4 细胞凋亡Tunnel染色阳性病理图（400×）

表2 两组胎盘组织细胞凋亡率比较（%，±s）

表2 两组胎盘组织细胞凋亡率比较（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；FGR：胎儿生长受限

?

[1]Harding R，Cock ML，Louey S，et al.The compromised intrauterine enviroment：implications for lung health[J].Clin Exp Pharma Physiol，2000，27（10）：965-967.

[2]乐杰.妇产科学[M].7版，北京：人民卫生出版社，2008：130-132.

[3]杨敬一，俞艇蔚.胰岛素样生长因子瘦素与胎儿生长受限的相关性研究[J].医药论坛杂志，2011，32（24）：6-7.

[4]徐月芳，凌奕，林叶飞，等.胎儿生长受限患者sFlt-1、PLGF的表达及其意义[J].海南医学院学报，2012，18（6）：838-839.

[5]秦江霞，贾金平，岳玉焕.HIF-1α、VEGF在胎儿生长受限患者胎盘组织中的表达及意义[J].中国优生与遗传杂志，2012，20（12）：47-48，53.

[6]叶艳贞，陈建宇，刘建玲，等.胎儿生长受限与抗心磷脂抗体的相关性[J].中国医药导报，2010，7（29）：36-37.

[7]Shen SF，Hua CH.Effect of L-arginine on the expression of Bcl-2 and Bax in the placenta of fetal growth restriction[J].Matern Fetal Neonatal Med，2011，24（6）：822.

[8]王铁军，屈新中.胎儿生长受限胎盘组织中细胞凋亡与增殖[J].中国妇幼保健，2010，25（33）：4873-4876.

[9]崔世红，张婷，管秀娟，等.特发性胎儿生长受限患者胎盘组织中XIAP和Bax的意义[J].中国妇幼保健，2012，27（13）：2030-2032.

[10]江燕萍，孟锦绣，林燕燕.Apelin/APJ在胎儿生长受限胎盘组织中的表达及其临床意义[J].现代医院，2011，11（9）：15-16.

[11]黄莺，孙海燕，李小英，等.胎膜早破孕妇血清白细胞介素-6、细胞黏附因子-1的表达及其临床意义[J].中国医药导报，2013，10（4）：57-59.

[12]颜耀华，李力，王云，等.胎盘生长因子于胎儿生长受限时在胎盘及蜕膜组织中的表达[J].第三军医大学学报，2007，29（3）：203-206.

[13]王秀，苟文丽，朱广侠.胎儿生长受限孕妇血清皮质醇浓度与胎盘组织IGF-1表达水平研究[J].实用妇产科杂志，2005，21（2）：87-90.

[14]崔世红，张婷，刘萍萍，等.激活素A、Bax和XIAP在特发性胎儿生长受限患者的表达及意义[J].实用妇产科杂志，2012，28（3）：211-214.

[15]Rasheva VI，Domingos PM.Cellular responses toendoplasmic reticulum stress and apoptosis[J].Apoptosis，2009，14（8）：996-1007.

Expression and significance of CHOP/GADD153 in p lacenta of fetal grow th restriction

LIN Haiying ZHANG Yanhua WANG Kaiming HUANG Xiaohong
Department of Obstetrics,Bao'an Maternal and Child Health Hospital in Shenzhen City,Guangdong Province,Shenzhen 518100,China

Objective To investigate the expression and significance of endoplasmic reticulum stress homologous protein(CHOP/GADD153)in placenta of fetal growth restriction(FGR).Methods 46 patientswith FGR from July 2012 to May 2013 in Bao'an Maternal and Child Health Hospital in Shenzhen City were selected as FGR group,34 normal pregnantwomen in the same term were selected as control group.Placental CHOP/GADD153 expression was evaluated by immunohistochemistry.Placental apoptosis was assessed by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling(Tunel)assay.Resu lts The positive expression rate of CHOP/GADD153 in FGR group was 67.8%, which was higher than that in control group(14.7%),the differences were statistically significant(χ2=7.57,P＜0.01). The apoptotic ratio in FGR group was(37.6±5.3)%,which was higher than that in control group[(12.3±1.5)%],the differences were statistically significant(t=2.342,P＜0.05).Conclusion Apoptosismediated by endoplasmic reticulum stress homologous protein(CHOP/GADD153)is correlated with nosogenesis of FGR.

Fetal growth restriction;Endoplasmic reticulum stress;Apoptosis

R714.4

A

1673-7210（2014）01（b）-0017-03

2013-11-07本文编辑：李继翔）

广东省深圳市科技计划项目（医疗卫生类）（编号2012 03265）。