四妙丸对高脂饮食胶原诱导关节炎大鼠血脂及关节的影响

陈 哲 杨思思 王 玉 刘亚飞 涂胜豪

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合科，湖北武汉430030；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院综合科，湖北武汉430030

四妙丸对高脂饮食胶原诱导关节炎大鼠血脂及关节的影响

陈 哲1杨思思2王 玉1刘亚飞1涂胜豪1

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合科，湖北武汉430030；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院综合科，湖北武汉430030

目的比较四妙丸和甲氨蝶呤对高脂饲料胶原诱导关节炎（CIA）大鼠的影响，明确四妙丸对关节炎和血脂的影响。方法选用W istar大鼠建立高脂饲料的关节炎模型，观察四妙丸和甲氨蝶呤两种治疗4周后大鼠关节炎指数积分、滑膜HE染色以及检测血清中血脂和炎症因子的浓度。结果CIA大鼠经甲氨蝶呤和四妙丸治疗后关节炎指数积分均明显下降，病理切片的滑膜增生层次和炎症细胞浸润均明显改善。与甲氨蝶呤组比较，四妙丸组血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平明显降低（P＜0.01），而高密度脂蛋白胆固醇则明显升高（P＜0.01）；前炎症因子肿瘤坏死因子-α浓度下降（P＜0.05），而白介素-17浓度则明显升高（P＜0.05）。结论四妙丸可能兼具有抑制免疫和降低血脂的作用来阻止CIA的进展。

四妙丸；高脂饲料；胶原诱导关节炎；W istar大鼠

类风湿关节（rheumatoid arthritis，RA）是以对称性多关节炎病变为主要临床表现的全身性自身免疫性疾病，其特点是关节滑膜的慢性炎症及软骨吸收和骨质破坏，最终导致关节强直、畸形、功能的丧失。最近研究表明，RA患者心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的发病风险明显增加，RA患者中急性心肌梗死概率较正常人提高约1.6倍，而RA患者的平均寿命较正常人群减少15～18年，心脑血管急性事件是导致RA患者死亡的主要原因[1]。进一步研究发现，肥胖和血脂异常的RA患者比例较正常人明显增高，易发生动脉粥样硬化的倾向，可能是心血管事件死亡率增高的原因[2]。已有报道表明肥胖可明显加重关节炎进展[3]。

RA属中医学痹证范畴，四妙丸具有清热利湿之功效，临床研究表明其治疗活动性RA有效[4]，但其治疗机制目前未见报道。本研究拟在胶原诱导关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型基础上，探讨四妙丸对高脂饲养CIA大鼠的血脂和关节影响，以揭示四妙丸治疗RA的现代分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康清洁级Wistar大鼠60只，雌性，4～5周龄，体重（170±15）g，由华中科技大学同济医学院动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2009-0005。

1.2 试药与仪器

牛Ⅱ型胶原、不完全弗氏佐剂均购于美国Chondrex公司，甲氨蝶呤由上海信谊药厂有限公司生产，四妙丸由吉林紫鑫药业股份有限公司生产，大鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL）-1β和IL-17 ELISA试剂盒由北京达科为公司生产，总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒均购于上海名典生物工程有限公司。半自动生化分析仪由山东高密彩虹分析仪器有限公司提供，恒低温离心机由美国Sigma公司提供。

1.3 方法

1.3.1 动物分组选取15只大鼠给予普通饲料作为正常对照组，另45只大鼠给予高脂饲料[5]（蔗糖∶猪油∶奶粉∶鸡蛋∶普通饲料=30∶20∶4∶2∶63），建立CIA模型，大鼠共成模38只，随机分为三组，其中模型组12只，四妙丸组13只，甲氨蝶呤组13只。

1.3.2 造模方法按文献[6]方法，将牛Ⅱ型胶原10 mg与等体积的不完全弗氏佐剂充分乳化，在无菌条件下，按每点皮下注射乳剂0.05mL，初次免疫在大鼠背上任选3点，加强免疫于2周后同法二点注射。

1.3.3 灌胃给药初次免疫后第4周开始每天1次灌胃治疗，以体重计算，四妙丸为临床人用剂量的10倍，每只大鼠按每100克体重灌胃1mL，甲氨蝶呤按计量0.5 mg/kg灌胃给药，同时正常对照组和模型组给予生理盐水灌胃，各组均治疗4周。

1.3.4 关节症状评分采用关节炎指数积分法评定[7]，评定依据为关节红肿程度和范围以及关节肿大和变形情况。0分：无红肿；1分：趾关节稍红肿，足爪或足垫单个区域炎症；2分：关节轻度红肿，足爪或足垫或踝关节两个区域以上的炎症；3分：关节中度红肿，轻度功能障碍；4分：关节严重红肿，僵直甚至畸形，严重功能障碍。

1.3.5 关节滑膜病理分析初次免疫后第8周处死各组大鼠，取滑膜组织，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片常规脱蜡至水，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察组织形态变化。

1.3.6 血清血脂和细胞因子的检测初次免疫后第8周，处死各组大鼠前禁食12 h，腹主动脉取血，分离血清检测TG、TC、HDL-C和LDL-C水平，利用ELISA试剂盒检测上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-17的含量，按照说明书操作，酶标测试仪450 nm处读数。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

与正常对照组[（315.6±14.8）g]比较，模型组大鼠体重[（350.4±37.2）g]明显增加（P＜0.05），而四妙丸组体重[（328.3±17.7）g]下降，较模型组和甲氨蝶呤组[（341.9±34.3）g]差异有统计学意义（P＜0.05）。造模成功后关节炎大鼠第10天开始逐渐出现关节炎症状，第2次免疫后关节炎症状持续加重，四妙丸组和甲氨蝶呤治疗后关节炎症状较模型组明显改善。

2.2 关节炎指数评分

随着免疫时间延长，正常对照组大鼠关节炎指数评分差异无统计学意义（P＞0.05），模型组关节炎指数评分逐渐增加，四妙丸组和甲氨蝶呤组关节炎指数评分随时间逐步下降，初次免疫41 d后与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠关节炎指数评分

2.3 关节炎病理切片

正常对照组大鼠滑膜组织未见明显的新生血管及炎症细胞浸润，滑膜细胞呈单层规则排列。模型组大鼠的滑膜组织中光镜下可见到淋巴组织浸润，滑膜细胞层次增多，可达十多层，排列紊乱，毛细血管增生明显，血管翳形成，滑膜下层纤维组织增生，胶原纤维沉着，炎症细胞浸润以及肉芽组织形成。四妙丸组和甲氨蝶呤组滑膜增生层次和炎症细胞浸润明显减轻。见图2。

图2 滑膜病理切片（HE染色，×400）

2.4 各组血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C水平比较

模型组TG、TC及LDL-C水平较正常对照组明显增加（P＜0.01），而HDL-C明显下降（P＜0.01）（表1）。甲氨蝶呤组与模型组比较TG、TC、HDL-C及LDL-C差异均无统计学意义（P＞0.05）；四妙丸组TC及LDL-C较模型组明显下降（P＜0.01），而HDL-C则明显升高（P＜0.01）；四妙丸组TC及LDL-C与甲氨蝶呤组比较明显下降（P＜0.01），而HDL-C则明显升高（P＜0.01）。见表2。

表1 正常对照组与模型组大鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

表1 正常对照组与模型组大鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

表2 各治疗组与模型组大鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

表2 各治疗组与模型组大鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01；与甲氨蝶呤组比较，▲P＜0.01；TG：三酰甘油；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

?

2.5 各组血清中TNF-α、IL-1β和IL-17水平比较

与正常对照组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-17水平均明显增高，差异有高度统计学意义（P＜0.01），见表3。与模型组比较，四妙丸组和甲氨蝶呤组各炎症因子水平均明显下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；四妙丸组与甲氨蝶呤组比较，TNF-α水平下降（P＜0.05），而IL-17水平则明显升高（P＜0.05）。见表4。

表3 正常对照组与模型组大鼠血清炎症因子水平比较s）

表3 正常对照组与模型组大鼠血清炎症因子水平比较s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；TNF：肿瘤坏死因子；IL：白介素

表4 治疗组与模型组大鼠血清中炎症因子水平比较±s）

表4 治疗组与模型组大鼠血清中炎症因子水平比较±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01；与甲氨蝶呤组比较，▲P＜0.05；TNF：肿瘤坏死因子；IL：白介素

?

3 讨论

RA病程中由于滑膜的慢性炎症和血管翳形成可侵蚀多个关节的骨和软骨组织导致关节破坏功能丧失，CIA大鼠是目前公认研究RA理想的动物模型。RA滑膜细胞及滑膜组织中浸润的单核巨噬细胞、淋巴细胞等产生大量的细胞因子，这些细胞因子通过作用于多种细胞并相互调节，形成一个复杂的网络，促进了RA的发生和发展。在RA细胞因子相互作用网络中，IL-1和TNF-α处于中心位置，二者均能促进滑膜及软骨细胞产生胶原酶和前列腺素E2而致关节破坏，局部的免疫复合物和游离胶原等又促使IL-1和TNF-α合成增加，加重炎症损伤，其在RA发病中起着重要作用[8]。IL-17是一种强大的前炎症细胞因子，也是炎性反应的微调因子，由Th17细胞分泌产生，IL-17可通过上调软骨细胞及滑膜成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMP-1/3/13）的表达，进而增强聚合素酶及胶原酶活性，促进软骨蛋白多糖和胶原降解，抑制软骨细胞蛋白多糖的合成，并可增强单核细胞对软骨基质的破坏[9]。

最近有文献报道，肥胖可能是RA发展的风险因子，肥胖人群发病率的提高可能直接导致RA发病率的升高[10]。此外，肥胖会导致RA病情预后更差，一方面是心脑血管疾病的并发症风险增高，另一方面可能对抗风湿病药物（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs）的治疗反应下降[11-13]。降血脂他汀类药物常用于控制高胆固醇血症、心血管疾病和炎症患者的脂质代谢紊乱，因为其具有抗炎、抗氧化剂、免疫调节和抗血栓作用。有临床研究显示，阿伐他汀具有改善RA患者关节炎症状的作用[14-15]。

四妙丸出自于清代张秉成《成方便读》，由二妙丸加入牛膝、薏苡仁化栽而来。四妙丸中苍术苦而温，芳香而燥，直达中州，为燥湿健脾之主药；黄柏为苦寒下降之品，入肝肾清下焦之湿热；牛膝补肝肾强筋骨，领苍术、黄柏入下焦而祛湿热也；薏苡仁独入阳明经，祛湿热而利筋络。诸药相合清流洁源，标本兼顾，具有清热利湿、宣痹通络之功，使湿热得除，诸症自愈[16]。

本研究通过建立高脂CIA大鼠做对照，同时设立正常大鼠进行比较，结果发现高脂饲料的CIA大鼠血清中血脂TC、TG和LDL-C水平较普通饲料大鼠均明显增高（P＜0.01），而HDL-C明显降低（P＜0.01）；与此同时，胶原免疫后关节炎评分明显高于正常组，分别给予甲氨蝶呤和四妙丸治疗后，关节炎指数评分明显下降，免疫后41 d与CIA模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；滑膜病理学积分证实给药组的滑膜细胞增生、血管翳形成和炎症细胞浸润明显下降；血清中血脂指标检测发现，四妙丸组大鼠TC和LDL-C水平明显下降，而HDL-C水平明显升高，与甲氨蝶呤组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；四妙丸组治疗后血清中前炎症因子TNF-α与甲氨蝶呤组治疗后比较明显下降（P＜0.05），但IL-17水平却明显高于甲氨蝶呤组（P＜0.05）。

四妙丸治疗RA的机制可能是通过以下途径实现的：①四妙丸中黄柏、苍术、薏苡仁、牛膝均具有调节免疫抗炎镇痛作用能阻断炎症细胞因子网络的“瀑布效应”，阻断关节病变进程。②高脂血症和肥胖是RA的风险因子，二者均可加重RA病情，而四妙丸通过健脾祛湿的方法可明显改善血脂异常，进而改善RA的关节炎症状。③四妙丸与甲氨蝶呤相比，其针对改善炎症因子TNF-α的作用更强，进一步说明了TNF-α可能是肥胖和关节炎的中轴性作用靶点，但多个免疫因子和免疫细胞参与了RA的发展，针对单一因子治疗不能根本控制炎症的发展和预后。

总之，本研究通过比较四妙丸和甲氨蝶呤治疗高脂CIA大鼠的关节炎及血清中炎症因子的变化，发现二者均能改善CIA关节炎进程，而四妙散兼具有改善血脂的作用，这将有助于对RA发生机制进一步认识，同时为指导RA治疗和预防提供了更加科学的实验依据。

[1]Semb AG，Kvien TK，Aastveit AH，et al.Lipids，myocardial infarction and ischaemic stroke in patientswith rheumatoid arthritis in the Apolipoprotein-related Mortality RISk（AM ORIS）Study[J].Ann Rheum Dis，2010，69（11）：1996-2001.

[2]Stavropoulos-Kalinoglou A，MetsiosGS，Panoulas VF，etal. Associations of obesity with modifiable risk factors for the development of cardiovascular disease in patients with rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2009，68（2）：242-245.

[3]Jhun JY，Yoon BY，Park MK，et al.Obesity aggravates the joint inflammation in a collagen-induced arthritismodel through deviation to Th17 differentiation[J].Exp MolMed，2012，44（7）：424-431.

[4]杨波，梁清华，吴丹，等.四妙丸联合西药治疗活动期类风湿关节炎20例临床观察[J].中医杂志，2011，52（18）：1566-1569.

[5]龚艳琳，陆付耳，董慧，等.交泰丸及其单味药对大鼠2型糖尿病的治疗作用[J].中国医院药学杂志，2010，30（5）：356-360.

[6]Trentham DE，Townes AS，Kang AH.Autoimmunity to typeⅡcollagen an experimentalmodelofarthritis[J].JExp Med，1977，146（3）：857-868.

[7]汤文璐，李俊，徐叔云，等.Ⅱ型胶原关节炎动物模型的研究概况[J].中国药理学报，1998，14（6）：495-498.

[8]岳燕林，刘剑平，蒋红，等.乙酰唑胺对类风湿关节炎滑膜细胞增殖及TNF-α及IL-1β的影响[J].免疫学杂志，2013，29（9）：826-828.

[9]赵婷，郭亚春，高亚贤，等.薯茵皂昔元含药血清对IL-17和TNF-α诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364 NF-κB、AP-1的影响[J].中华中医药杂志，2013，28（9）：2794-2797.

[10]Crowson CS，Therneau TM，Davis JM，etal.Contribution of obesity to the rise in incidence of rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Care Res（Hoboken），2013，65（1）：71-77.

[11]Ajeganova S，Andersson ML，Hafstrmo I，et al.Association ofobesitywith worsediseaseseverity in rheumatoid arthritisaswellaswith comorbidities：a long-term followup from disease onset[J].Arthritis Care Res，2013，65（1）：78-87.

[12]Klaasen R，Wijbrandts CA，Gerlag DM，et al.Bodymass index and clinical response to infliximab in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2011，63（2）：359-364.

[13]Gremese E，Carletto A，Padovan M，et al.Obesity and reduction of the response rate to anti-tumor necrosis factor αin rheumatoid arthritis：an approach to a personalized medicine[J].Arthritis Care Res，2013，65（1）：94-100.

[14]Mccarey DW，Mcinnes IB，Madhok R，etal.TrialofAtorvastatin in Rheumatoid Arthritis（TARA）：double-blind，randomised placebo-controlled trial[J].Lancet，2004，363（9426）：2015-2021.

[15]徐素粉，赵福涛，赵浩，等.FasL基因关节腔内转染对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的影响[J].医学综述，2012，18（3）：443-445.

[16]王晓玉，张晓兰，张丽，等.四妙丸对大鼠佐剂性关节炎作用机制的研究[J].中国中药杂志，2010，35（21）：2889-2892.

Effects of Sim iao Pills on blood lipid and joints of high-fat diet collageninduced arthritis rats

CHEN Zhe1YANG Sisi2WANG Yu1LIU Yafei1TU Shenghao1
1.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Hubei Province,Wuhan 430030,China;2.Department of Comprehensive,Tongji Hospital Affiliated to TongjiMedical College of Huazhong University of Science and Technology,HubeiProvince,Wuhan 430030,China

Objective To determine the effects of Simiao Pills on arthritis and blood lipids by comparing the influences of Simiao Pills and Methotrexate(MTX)on high fat diet collagen-induced arthritis(CIA)rats.Methods The arthritis modelwas established with high fat diet in Wistar rats.The rat arthritis index points and synovial HE staining were observed after 4 weeks of Simiao Pills and MTX treatment as well as the concentration of serum lipids and inflammatory factors were detected.Results The arthritis index score of CIA rats decreased significantly in both MTX and Simiao Pills treatment group.The synovial proliferation level and infiltration of inflammatory cells significantly improved in pathological sections.In Simiao Pills group,the serum TC,LDL-C levels decreased significantly compared with that in MTX group(P＜0.01),while the HDL-C level increased significantly(P＜0.01);the concentration of proinflammatory cytokine factor TNF-αdecreased(P＜0.05),the concentration of IL-17 significantly increased(P＜0.05).Conclusion Simiao Pills can both suppress the immune and lower the blood lipid to prevent the progress of CIA.

Simiao Pills;High fat diet;Collagen-induced arthritis;Wistar rats

R593.22

A

1673-7210（2014）01（b）-0024-04

2013-11-06本文编辑：程铭）

陈哲（1980.10-），男，博士；研究方向：中西医结合风湿病学。

涂胜豪（1965.11-），男，教授，主任医师；研究方向：中西医结合风湿病学。