罗格列酮对BIU-87膀胱癌细胞系转移能力的影响

何 毅，李映川，章 卓

(泸州医学院1.附属医院泌尿外科;2.药理教研室，四川泸州646000)

膀胱癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率居恶性肿瘤第9位，发生机制尚不清楚，过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activatcd receptor-γ，PPAR-γ)是一种细胞内的转录因子，与肿瘤细胞的分化、增殖密切相关，PPAR-γ 可能与膀胱癌发生、转移和侵袭有关［1］。罗格列酮属于噻唑烷二酮类药物，是过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂。据此，通过罗格列酮干预后观察BIU-87 膀胱癌细胞系的侵袭和黏附能力，可以判断PPAR-γ 与膀胱癌体外侵袭和黏附能力的关系，为膀胱癌可能的转移机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂:BIU-87 膀胱癌细胞系(上海拜力生物试剂有限公司);PPAR-γ 激动剂罗格列酮(浙江万马公司);Transwell小室(Costar Cambridge 公司);Matrigel 胶;趋化因子人纤连蛋白(BD 公司);CCK-8 试剂盒(碧云天生物技术研究所);兔抗人PPAR-γ、MMP-9 和β-actin 抗体及羊抗兔二抗(Abcam 公司)。

1.2 CCK-8 法检测罗格列酮对BIU-87 膀胱癌细胞活力影响:BIU-87 膀胱癌细胞常规培养。取5 ×105个/L 对数增殖期BIU-87 膀胱癌细胞接种到96 孔板中，24 h 后将96 孔板分为对照组、罗格列酮5、10、20、40 和80 mg/L 组，每个浓度4个复孔，处理24 h 后每孔加入CCK-8 10 μL 继续培养1 h，酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度值，以A 值反映细胞活力情况。实验重复3 次。抑制率= (1－实验组A 值/对照组A值)×100%。

1.3 罗格列酮对BIU-87 膀胱癌细胞侵袭能力的影响:Transwell 小室4 ℃预冷，将趋化因子人纤连蛋白(fibronectin，FN)涂于小室下层，Matrigel 胶包被于小室上层，37 ℃孵育1 h。根据1.2 结果，将实验分为对照组、罗格列酮10 和20 mg/L组。实验步骤为先将对数生长期的BIU-87 膀胱癌细胞经罗格列酮处理24 h，对照组细胞正常培养不作处理。之后收集细胞，取5×105个/L 细胞悬浮于小室的上层，小室下方加入含0.1%牛血清蛋白的培养基600 μL，37 ℃孵育24 h。经多聚甲醛固定，HE 染色。每组4 个复孔，显微镜下选取5 个视野计算穿过滤膜的细胞数，计算平均值和比值。实验重复3 次。

1.4 罗格列酮对BIU-87 膀胱癌细胞黏附能力的影响:实验分组同1.3。罗格列酮处理24 h 后，收集细胞5 ×105个/L接种在铺有Matrigel 胶的24 孔板中，37 ℃孵育1 h，弃培养基，PBS 洗3 次，加入20 μL MTS，37 ℃孵育2 h。用酶标仪测定黏附在Matrigel 胶上细胞的A 值(波长490 nm)。

1.5 免疫印迹法检测PPAR-γ 和MMP-9 蛋白表达:实验处理同1.3，将细胞加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液0.5 mL冰上裂解。转入1.5 mL 离心管中，4 ℃12 000 × g 15 min，吸取上清。采用4%浓缩胶和8%分离胶，SDS-PAGE电泳，100 V 转膜120 min，转膜后将硝酸纤维素膜放入封闭液中，摇床缓慢摇动，封闭1.5 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，加入二抗，孵育，洗膜。以β-actin 为内参，用图像分析仪对条带进行扫描。

2 结果

2.1 罗格列酮对BIU-87 膀胱癌细胞活力影响:40 mg/L 以上浓度罗格列酮对细胞有严重不良反应(图1)。

2.2 罗格列酮对BIU-87 膀胱癌细胞黏附能力与侵袭能力的抑制作用:10 mg/L 与20 mg/L 罗格列酮使BIU-87 膀胱癌细胞黏附能力降至对照组的61.2% 和38.6% (P＜0.05)，10 和20 mg/L 罗格列酮使BIU-87 膀胱癌细胞MMP-9蛋白表达减弱(P＜0.05)，PPAR-γ 表达增强(P＜0.05)(图2)，侵袭能力是对照组的42.3% 和21.6%(P＜0.05)(图2)。10 和20 mg/L 罗格列酮使BIU-87 膀胱癌细胞MMP-9 蛋白表达减弱(P＜0.05)，PPAR-γ 表达增加(P＜0.05)(图2)。

图1 不同浓度罗格列酮对BIU-87 膀胱癌细胞活力影响Fig 1 Effects of rosiglitazone on BIU-87 cells vitality

3 讨论

肿瘤转移包括肿瘤细胞脱离原发部位，穿越基质组织和血管壁，进入循环系统，形成远端转移。膀胱癌患者保留膀胱术后2年内复发率高达50%［2］。膀胱癌的发生、浸润和转移涉及多种因素，PPAR-γ 与MMP-9 都与膀胱癌该转移有关。PPAR-γ 是一种细胞内的转录因子，与肿瘤细胞的分化、增殖密切相关。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)参与了膀胱癌的转移，MMP-9 可能通过降解包括基底膜Ⅳ型胶原在内的细胞外成分，使癌细胞向深层间质浸润的同时也突破淋巴管和血管的基底膜而向脉管浸润，最终发生转移［3］。已有研究表明罗格列酮可通过激活PPAR-γ而发挥抗肿瘤作用。因此，本实验通过罗格列酮干预，观察PPAR-γ 表达增加后对膀胱癌细胞体外黏附能力与侵袭能力的影响，同时检测MMP-9 蛋白表达。

实验结果显示，罗格列酮干预后，BIU-87 膀胱癌细胞黏附能力与侵袭能力下降明显，证实PPAR-γ 激动后可以影响膀胱癌细胞侵袭能力和黏附能力，提示PPAR-γ 参与了膀胱癌的转移过程。同时BIU-87 膀胱癌细胞MMP-9 蛋白表达减弱，提示罗格列酮在激动PPAR-γ 时可能对MMP-9 还存在抑制效应，对膀胱癌细胞侵袭能力和黏附能力的影响可能也与抑制MMP-9 蛋白表达有关。

综上所述，PPAR-γ 在膀胱癌转移中有重要价值，这为今后进一步以PPAR-γ 基因作为靶点应用于膀胱癌的治疗提供了科学依据。

图2 罗格列酮对BIU-87 膀胱癌细胞黏附能力与侵袭能力的抑制作用及对MMP-9 和PPAR-γ 蛋白表达的影响Fig 2 Effect of rosiglitazone on adhesion ability and invasion ability of BIU-87 cells(n=4)and the expressions of MMP-9 and PPAR-γ(n=3)

［1］Sugiyama N，Yoneyama MS，Hatakeyama S，et al．In vivo selection of high-metastatic subline of bladder cancer cell and its characterization［J］．Oncol Res，2013，20:289-295．

［2］Kaur J，Sanyal SN．Modulation of inflammatory changes in early stages of colon cancer through activation of PPAR gamma by diclofenac［J］．Eur J Cancer Prev，2010，19:319-327．

［3］Said N，Sanchez-Carbayo M，Smith SC，et al．RhoGDI2 suppresses lung metastasis in mice by reducing tumor versican expression and macrophage infiltration［J］．J Clin Invest，2012，122:1503-1518．