Skp2反义寡核苷酸对大肠癌细胞SW480生长和增殖的影响

聂 伟，周洪伟，王继建

(1.武警重庆总队医院甲乳血管外科 400061；2.重庆医科大学第二附属医院普外科 400010；3.浙江省杭州师范大学附属医院普外科 310015)

泛素-蛋白酶体途径是真核细胞内蛋白质选择性降解的重要方式。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)作为一个非常重要的F-box蛋白，参与泛素-蛋白酶体中作为泛素连接酶复合物SCF的组成，同时也是参与降解细胞周期抑制因子P27kip1重要蛋白[1]。根据既往的研究结果显示，Skp2和P27kip1分别扮演了原癌基因和抑癌基因的角色，并且在大肠癌组织中的表达呈显著负相关[2]。那么这种关系发生的相关机制是什么？以及它们之间是怎样进行调控？作者针对Skp2在大肠癌中过表达的特点，设计合成了以Skp2为靶点的高度特异性的反义寡核苷酸序列(antisense oligodeoxynucleotide ASODN)，通过对Skp2表达的反义抑制作用，从分子生物学角度探讨Skp2与P27kip1蛋白表达呈负相关的可能机制，同时也为大肠癌的基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1试剂 大肠癌细胞株SW480，购于第四军医大学实验动物中心；Skp2 ASODN、无义寡核苷酸(Nonsense oligodeoxynu-cleotide,NSODN)和内标GAPDH引物均由上海生物工程公司合成；脂质体 Lipofectamine TM2000购于美国Invitrogen公司；Trizol试剂盒购于北京鼎国生物技术有限责任公司；RT-PCR试剂盒购于Takara宝生物工程(大连)有限公司。

1.2方法

1.2.1Skp2 ASODN的设计与合成 参阅相关文献，并根据Skp2mRNA(GenBank:NM-005983)起始密码子后180～196 bp碱基序列，设计与其互补的17个碱基寡聚物。Skp2 ASODN序列为 5′-CCT GGG GGA TGT TCT CA- 3′ ；Skp2 NSODN序列为5′-GGC TTC CGG GCA TTT AG-3′,Skp2 NSODN序列的碱基数目及比例与Skp2 ASODN相同，但序列随机排列，经GenBank检索不与基因组序列配对。

1.2.2引物设计与合成 内标GAPDH引物参照文献。Skp2、P27kip1引物以NewStar软件自行设计。GAPDH上游引物：5′-CCA TGG AGA AGG CTG GGG-3′，下游引物：5′-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3′，扩增产物为195 bp。P27kip1上游引物：5′-CGT GGC TCG TCG GGG TCT GTG TCT-3′， 下游引物：5′-GGG GCC GCG GGG GTC TGT AGT AG-3′，扩增产物431 bp。Skp2上游引物：5′-AAG AGG AGC CCG ACA GTG AGA ACA-3′,下游引物：5′-GAC AGT ATG CCG TGG AGG GTG GAC-3′，扩增产物481 bp。

1.2.3噻唑蓝(MTT)检测Skp2 ASODN对SW480细胞的增殖抑制影响 将SW480细胞以细胞密度为2×105/mL，接种于96孔培养板。分别加入Skp2 ASODN和Skp2 NSODN，终浓度分别为0.050、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 μmol/L，每组接种5孔，每孔总体系保持200 μL。空白对照组加入等量无血清、无抗生素的RPMI-1640液。孵育12 h后，弃去转染液，添加含血清RPMI-1640培养液200 μL，继续培养72 h。每孔加入MTT(浓度5 mg/mL)20 μL，继续孵育4 h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每组取3孔加入150 μL 二甲基亚砜，振荡10 min，并在酶联免疫检测仪上测定各孔490 nm波长吸光度值(A值)。细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组A值/对照组A值)]×100%。每组另外2孔在倒置显微镜下观察其生长情况。

1.2.4流式细胞仪检测Skp2 ASODN对SW480细胞周期影响 取对数生长期SW480细胞，经稀释成终浓度为3.5×105/50 mL细胞悬液后继续培养24 h，分别加入Skp2 ASODN、Skp2 NSODN至终浓度1.0 μmol/L，加入无血清的培养液使总的体系为200 μL，转染12 h。吸去转染液后，添加含有血清的培养液，置于37 ℃、5% CO2孵箱培养72 h。收集细胞，调整细胞终浓度为1×106/mL，经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，-4 ℃预冷的70%乙醇固定1 h，加RNA酶(100 μg/mL，罗氏公司)500 μL，30 min，加50 μg/mL 碘化丙啶(PI)500 μL，30 min，混合液用300目尼龙网除去杂质。用流式细胞仪进行细胞周期分析。

1.2.5RT-PCR检测Skp2 mRNA和P27kip1mRNA 实验分为ASODN、NSODN和对照组。细胞接种和转染方法同上。PBS洗涤各组细胞，用Trizol核酸提取试剂盒，按照说明分别提取各组细胞中的总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明操作，反应体系为20 μL，反应条件为37 ℃恒温类30 min，95 ℃ 5 min中止反应，随后进行PCR反应。取逆转录的cDNA产物2 μL，分别加入10×RT缓冲液4.5 μL，Taq酶1 μL，DEPC-ddH2O 42.5 μL，上、下游引物各50 pmoL，反应体系为50 μL进行RT-PCR反应。Skp2扩增条件为94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 延伸5 min。P27kip1扩增条件为96 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。GAPDH扩增条件为95 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 延伸8 min。取PCR产物，经2.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶系统成像(美国Bio-Rad公司)，观察结果并照相。

1.2.6细胞免疫化学染色测定Skp2和P27kip1蛋白表达 取对数生长期SW480细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，以1×105/孔接种于12孔培养板中，置于37 ℃、5%饱和湿度条件下培养24 h，待细胞贴壁后，分别加入1 μmol/L Skp2 ASODN和NSODN，同时设立空白对照组。孵育12 h后，弃去转染液，添加含血清RPMI-1640培养液200 μL，继续培养72 h。经PBS清洗，经95%乙醇固定后，对细胞进行免疫化学染色。根据前期实验可知，Skp2 和P27kip1表达均位于细胞核，染色呈棕黄色或黄褐色。

2 结 果

2.1Skp2 ASODN对SW480细胞生长的影响 倒置显微镜下观察发现， 经过Skp2 ASODN处理72 h后，SW480细胞形态未见改变，但其生长速度明显减慢。见图1。

A:对照组细胞培养72 h;B:Skp2 ASOND处理后培养72 h。

图1 Skp2 ASODN对SW480细胞生长的影响

2.2MTT检测Skp2 ASODN对SW480细胞增殖的抑制作用 当Skp2 ASODN浓度达到0.125 μmol/L时，其A值与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，随着Skp2 ASODN浓度的增加，各浓度A值与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。当Skp2 NSODN浓度达到4.000 μmol/L时，其对细胞的增殖也显示抑制作用(P<0.01)，见表1。

表1 Skp2 ASODN、Skp2 NSODN作用SW480细胞后的A值及增殖抑制率

续表1 Skp2 ASODN、Skp2 NSODN作用SW480细胞后的A值及增殖抑制率

-：此项无数据。

2.3Skp2 ASODN对SW480细胞周期的影响 经Skp2 ASODN作用后，停留于G0/G1期SW480细胞增多(P<0.01)，而进入S期的细胞减少(P<0.05)，在G2/M期的细胞数量无明显改变(P>0.05)。见表2。

2.4Skp2 ASODN对Skp2、P27kip1mRNA表达的影响 RT-PCR实验结果显示，Skp2 ASODN作用后的SW480细胞中Skp2 mRNA表达降低，P27kip1mRNA表达无变化。见图2。

2.5Skp2 ASODN对Skp2、P27kip1蛋白表达的影响 细胞免疫化学结果显示，经Skp2 ASODN处理后SW480细胞中Skp2蛋白表达降低(染色减弱)，P27kip1蛋白表达增强(染色增强)。见图3。

表2 FCM检测Skp2 ASODN和Skp2 NSODN处理后SW480的细胞周期结果(%)

M:Marker;1：ASODN Skp2；2：ASODN P27kip1；3：GAPDH；4：NSODN Skp2；5：NSODN P27kip1；6：GAPDH；7：对照组 Skp2；8：对照组 P27kip1；9：GAPDH。

图2各组Skp2和P27kip1mRNA表达情况

A:经Skp2 ASODN处理后Skp2蛋白表达；B:经Skp2 NSODN处理后Skp2蛋白表达；C:经Skp2 ASODN处理后P27kip1蛋白表达；D:经Skp2 NSODN处理后P27kip1蛋白表达。

图3经Skp2 ASODN、NSODN处理后Skp2、P27kip1蛋白变化(SP×200)

3 讨 论

细胞周期是生命活动的基础，通过有效的内外调控作用，保证细胞周期有序地进行。肿瘤则是一类渐进性细胞周期调控机制紊乱的疾病，因此，对肿瘤细胞周期调控机制的研究，对认识肿瘤的发生、发展，临床诊断与治疗有着重要意义。作为泛素连接酶，Skp2主要功能是特异性识别磷酸化的底物并介导其泛素化降解。研究显示，Skp2和细胞周期调控因子之间密切相关，如E2F、cyclinA、cyclinB、cyclinDl、cyclinE、p21、P27kip1和p53都是泛素蛋白酶体途径的底物[3-5]。近年研究发现 Skp2扮演着原癌基因的角色，参与了肿瘤的发生及发展。为了进一步研究Skp2对细胞调控因子的异常泛素化降解作用，Wei等[6]发现作为调节细胞周期泛素蛋白酶体之一的SCF复合体，可通过对Skp2的调节，发挥对细胞G1期的调控。Nelsen等[7]研究发现， cyclinE和Skp2转染大大缩短了肝细胞G1期向S期过渡时间，并且还促进大量肝细胞的复制和肝组织的增生，证实Skp2是一种参与G1期到S期过渡调控的蛋白，扮演致癌基因的作用。既往研究发现，在许多人类恶性肿瘤中，如食道鳞状上皮细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌以及前列腺癌等，Skp2均呈过表达[8-12]。以前的研究发现，Skp2在大肠癌中也呈过表达，扮演着癌基因的角色。

既往有关P27kip1的研究，主要是其对细胞周期的负性调控方面，发现在多种肿瘤中均有P27kip1表达的下调现象[13]，推测可能与细胞周期关卡G1/S抑制作用减弱有关。但近年来，随着对大量肿瘤细胞中Skp2和P27kip1的相关性研究发现，Skp2-P27kip1通路与人类恶性肿瘤发生存在密切关系，推测与泛素-蛋白酶体途径有关[14]。泛素-蛋白酶体途径是真核细胞选择性降解蛋白的重要途径，是参与调控细胞周期、基因转录及信号转导等过程中的关键机制。作为F-box蛋白家族成员之一，Skp2参与SCF复合体组成并起到了底物识别的作用，对细胞周期因子P27kip1进行特异性识别并降解，从而参与细胞周期调控。Miyamoto等[15]研究发现，Skp2和P27kip1在正常子宫内膜增生期和分泌期表达。59%的子宫内膜癌患者Skp2与P27kip1表达呈负相关。Xiang等[16]发现在鼻型自然杀伤T细胞淋巴瘤患者中，71%Skp2阳性，73% P27kip1阴性，两者呈负相关。此外，在乳腺癌、胆管癌等肿瘤中也有类似的报道[17]。本实验中，作者发现在大肠癌细胞中Skp2呈过表达，P27kip1表达下调，二者呈负相关，推测Skp2-P27kip1通路参与此过程，其可能的机制与泛素-蛋白酶体途径有关，主要发生在转录后水平。

作为调控和检测特定基因表达的重要方法，ASODN技术在近年来取得了显著的进步。ASODN技术具有合成方便、序列设计简单、选择性高、亲和力强等特点。通过本研究发现，利用ASODN的基因封闭和阻断技术，能有效抑制大肠癌细胞的增殖和生长，不仅证实了Skp2在大肠癌中扮演了原癌基因的角色，同时也为大肠癌的基因治疗提供实验依据。

综上所述，大肠癌同其他大多数肿瘤一样，可能也存在着过表达的Skp2以泛素-蛋白酶体途径从而对P27kip1产生过度降解，二者共同参与肿瘤的发生和发展。随着对Skp2和P27kip1研究的不断深入，二者在大肠癌细胞中是否还存在其他作用机制，有待进一步研究。

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