新型耐热植酸酶对断奶仔猪钙磷代谢及养分表观消化率的影响

曹贵彬 熊 昊* 游金明＊＊ 于会民韦启鹏 邹志恒 叶亚玲

(1.江西农业大学动物科技学院，南昌 330045;2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081;3.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，南昌 330200)

磷是畜禽机体内含量丰富的一种矿物元素，不仅参与畜禽骨骼、肌肉等组织的生成和生长，还参与畜禽生命活动的代谢过程。畜禽体内的磷主要来源于饲料，而植物饲料中的磷主要以植酸磷及植酸盐等形式存在，其中豆科、谷实等重要植物饲料中植酸磷含量更是占到了50%～75%。由于单胃动物体内缺乏能分解植酸磷和植酸盐的植酸酶，因此饲料中的磷很大一部分难以被单胃动物所利用。未被利用的磷随粪尿排出体外，不仅造成磷源的浪费，而且对环境造成严重污染［1］。而为了满足畜禽对磷的需要，向畜禽饲粮中添加一定比例的无机磷也增加了饲料成本。另外，畜禽机体对磷及其他其他矿物元素的吸收起协同作用，即畜禽对磷的吸收利用少也会影响到其他矿物元素的吸收利用，进而影响畜禽的生长发育［2］。研究表明，植酸酶能直接作用于植酸磷和植酸盐，释放被螯合的矿物元素，从而促进畜禽对钙、磷、铜、锌等矿物元素的吸收利用，进而促进机体肌肉、骨骼等组织的发育［3－5］。虽然目前大量研究报道了植酸酶可提高断奶仔猪的钙磷代谢，但鲜有从骨骼钙磷含量及骨骼切片组织学角度阐述其作用的研究。本试验旨在以断奶仔猪为研究对象，研究不同添加剂量耐热植酸酶替代饲粮中无机磷对断奶仔猪钙磷代谢的影响，为仔猪饲粮中科学利用耐热植酸酶及提高钙磷利用率、减少钙磷排放提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新型耐热植酸酶(NHP)活性含量为5 000 U/g。该酶是从大肠杆菌来源普通植酸酶经设计、突变、筛选及高效定向后获得的阳性突变体。普通植酸酶最适温度为45℃，比活性为2 957 U/mg，热稳定性较差，60℃处理10 m in后剩余酶活为40%。在制粒温度为80℃时，酶活性存余率仅为10%～30%。经筛选后的新型耐热植酸酶，最适pH5.0、同时具备耐80℃制粒高温、常温下高活性、抗蛋白酶降解等性能，比活性为4 000 U/mg。

1.2 试验动物与分组设计

选用遗传背景相同、初始体重为(8.37±0.97)kg、30日龄断奶的“杜×长×大”三元杂交仔猪256头，按照体重相近、性别比例一致的原则随机分为4个处理，每个处理设4个重复，每重复16头仔猪。

1.3 试验饲粮

4个处理仔猪分别饲喂基础饲粮(磷酸氢钙添加量为 1.32%，有效磷含量为 0.37%，对照)、低磷饲粮(磷酸氢钙添加量为0.72%，有效磷含量为0.24%，同时调整石粉和沸石粉添加量以保持饲粮钙水平不变)、低磷饲粮基础上添加0.01%新型耐热植酸酶制剂(植酸酶添加量为500 U/kg)、低磷饲粮基础上添加0.02%新型耐热植酸酶制剂(植酸酶添加量为1 000 U/kg)。各饲粮在正常条件下制成颗粒饲料。参照美国NRC(2012)猪饲养标准并结合生产实际配制基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 饲养管理

试验采用地面平养，在封闭式仔猪舍内进行。试验期内提供适宜的温湿度，自由采食和饮水。免疫消毒程序按猪场常规程序进行。饲养管理参照本品种猪的饲养规程执行。试验期为30 d。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 血清钙、磷含量及碱性磷酸酶(ALP)活性

于试验第30天，从每个重复选取3头中等体重、健康状况良好的仔猪空腹采血 5 m L，于3 000 r/m in离心10 m in，取血清，用于测定血清中钙、磷含量及碱性磷酸酶活性。

1.5.2 骨骼钙磷沉积

于试验第30天，从每个重复中选取1头中等体重、健康状况良好的仔猪屠宰，取其右侧后腿蹄骨，用手术刀小心剔除肌肉、筋脾及其他附着物，65℃烘干，放入乙醇∶苯混合液(混合比2∶1)中浸泡96 h脱脂，捞出，待乙醇:苯混合液挥发后，于105℃烘干至恒重，称重，600℃马福炉里灰化至恒重，称重，计算灰分率，并测定灰分中钙、磷含量。

1.5.3 趾骨组织学观察

取屠宰仔猪右侧后腿趾骨，用手术刀小心剔除肌肉、筋脾及其他附着物，置于10%甲醛中固定一段时间后，经脱钙、冲洗、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、染色及封片烘干之后，制成骨骼切片，于显微镜下对比观察各处理之间仔猪趾骨骨密质和骨松质的差异。

1.5.4 养分表观消化率

试验第28、29、30天，以重复为单位，用全收粪法收集粪便(200 g左右)，于105℃下烘干，回潮，称重，粉碎，保存。通过测定饲粮和粪便中粗蛋白质、能量、粗脂肪、钙、磷及干物质的含量来计算养分的表观消化率。

某养分表观消化率(%)=100×(饲料中

某养分含量－粪中某养分含量)/

饲料中某养分含量。

1.6 数据处理与统计分析

基本数据采用Excel 2003处理，血清钙、磷含量，血清碱性磷酸酶活性，骨骼钙、磷沉积及养分表观消化率结果分析采用SPSS 17.0中的one-way ANOVA程序进行方差分析，差异显著者用Duncan氏法进行多重比较。P＜0.05为差异显著判断标准。

2 结果

2.1 新型耐热植酸酶对断奶仔猪血清钙、磷含量及碱性磷酸酶活性的影响

新型耐热植酸酶对断奶仔猪血清钙、磷含量及碱性磷酸酶活性的影响见表2。表中数据显示，各处理仔猪血清中钙、磷含量及碱性磷酸酶活性均无显著差异(P＞0.05)。基础饲粮组(对照组)仔猪血清碱性磷酸酶活性最低，仅为354.23 U/L，低磷饲粮组、500 U/kg植酸酶添加组和1 000 U/kg植酸酶添加组分别比基础饲粮组高9.08%、6.22%和 7.73%;与低磷饲粮组相比，植酸酶添加组和基础饲粮组仔猪血清钙、磷含量有提高趋势。

表2 新型耐热植酸酶对断奶仔猪血清钙、磷含量及碱性磷酸酶活性的影响Table 2 Effects of NHP on Ca and P contents and ALP activity in serum of weaner piglets

2.2 新型耐热植酸酶对断奶仔猪骨骼钙、磷沉积的影响

表3数据显示，各处理仔猪蹄骨的骨重、灰分重、灰分率、钙和磷含量的变化差异均不显著(P＞0.05)。但低磷饲粮组仔猪蹄骨的灰分重、灰分率、钙和磷含量均最低，在低磷饲粮中添加500、1 000 U/kg新型耐热植酸酶后以上指标均有所改善，甚至略高于基础饲粮组。相比于低磷饲粮组，对照组及2个植酸酶添加组仔猪蹄骨的灰分重分别提高了 12.12%、6.06%和 13.64%，灰分率分别提高了 6.66%、11.32%和 6.14%;2 个植酸酶添加组仔猪蹄骨钙含量分别提高了3.97%和4.73%。

表3 新型耐热植酸酶对断奶仔猪蹄骨质量的影响Table 3 Effects of NHP on coffin bone quality of weaner piglets

2.3 新型耐热植酸酶对断奶仔猪趾骨发育的组织学差异

由图1可以看出，基础饲粮组仔猪趾骨骨密质菲薄，骨松质内骨小梁面积较大，但骨髓腔面积也较大，整体表现骨质较为疏松;低磷饲粮组骨密质菲薄，骨松质内骨小梁面积小，骨髓腔面积大，整体表现骨质疏松;添加500、1 000 U/kg新型耐热植酸酶后，仔猪趾骨骨密质较厚，骨松质内骨小梁面积大，骨髓腔面积较小，整体表现为骨质较为密集。

2.4 新型耐热型植酸酶对断奶仔猪养分表观消化率的影响

新型耐热型植酸酶对断奶仔猪养分表观消化率的影响见表4。表中数据显示，各处理仔猪粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率差异不显著(P＞0.05)，但基础饲粮组及2个植酸酶添加组仔猪的粗蛋白质和粗脂肪表观消化率相对低磷饲粮组均有提高的趋势。其中，500、1 000 U/kg植酸酶添加组的粗脂肪表观消化率达到55.97%和55.90%，分别比低磷饲粮组提高6.98%和6.84%。基础饲粮组和500、1 000 U/kg植酸酶添加组的总能、钙、磷及干物质的表观消化率均显著高于低磷饲粮组(P＜0.05)，但 3 组之间差异不显著(P＞0.05)。

3 讨论

3.1 新型耐热植酸酶对断奶仔猪血清钙、磷含量及碱性磷酸酶活性的影响

本试验结果显示，基础饲粮组因添加有大量的无机磷，满足了断奶仔猪对钙、磷的需求，而减弱了机体骨骼动员释放矿物元素的活动，最终使血清中碱性磷酸酶活性低于低磷饲粮组和2个植酸酶添加组。另外，相比较植酸酶对骨骼中钙、磷的沉积作用，植酸酶对血液中钙、磷含量变化几乎无影响。本试验结果与韩进诚等［6］用微生物植酸酶及周佳萍［7］用耐热植酸酶对肉鸡的试验结果吻合。

3.2 新型耐热植酸酶对断奶仔猪骨骼钙、磷沉积的影响

自20世纪初植酸酶面世以来，便有大量研究证实植酸酶具有降解被植酸螯合的钙、磷等矿物元素的作用，而一系列研究也发现，往畜禽饲粮中添加植酸酶能够提高饲粮中钙、磷、锰、锌、铜及铁等矿物元素的表观消化率，并促进畜禽对这些矿物元素在骨骼中的沉积，从而提高骨骼的灰分率［8－13］。但也有研究发现，低磷饲粮中添加植酸酶对肉鸡骨骼质量并无影响［14］。本试验结果显示，低磷饲粮中添加500、1 000 U/kg植酸酶，一定程度上促进了断奶仔猪对骨骼钙磷的沉积，在骨骼的灰分重和灰分率上达到了与添加无机磷一样的效果，但差异不显著，这与Behnam等［15］的植酸酶对肉鸡脚趾骨灰分试验的结果相似。出现这种情况可能与饲粮中高钙和低磷有关，影响了植酸酶的效果，使之尽管一定程度上起到了促进钙磷及其他骨骼成分沉积的作用，但不足以大幅度提高骨骼对矿物元素的吸收。

图1 断奶仔猪趾骨组织结构图Fig.1 Phalanges organizational structure of weaner piglets(100×)

表4 新型耐热植酸酶对断奶仔猪养分表观消化率的影响Table 4 Effects of NHP on apparent digestibility of nutrients of weaner piglets %

3.3 新型耐热植酸酶对断奶仔猪趾骨发育的组织学观察

骨骼主要是由矿物元素沉积而成型的，大体可以分为外层骨密质和由海绵状骨小梁支撑起的骨松质2个部分。当矿物元素沉积不够时，便容易出现骨密质变薄，骨小梁变小，骨髓腔增大的现象，是造成动物的骨折和骨质疏松的重要因素。刘宗平等［16］对沙质荒漠区的双峰驼研究发现，当土壤、牧草中磷含量偏低，牧草钙磷比值偏高时，双峰驼容易出现消瘦、异嗜、运动障碍、骨质疏松和容易骨折等病症。另有在对兔子的试验中也得出钙与兔应力性骨折有一定相关性的结论［17］。Ma等［18］的研究指出，锌能通过促进骨胶原蛋白的合成来刺激骨骼的生长。断奶仔猪磷缺乏或代谢异常，是导致不能钙化的肋骨胶原组织过度增生而形成佝偻病的主要原因。本试验通过对断奶仔猪趾骨制成的骨骼切片进行组织学观察发现，添加500、1 000 U/kg新型耐热植酸酶能增加骨密质厚度，增大骨小梁面积，减小骨髓腔面积，最终达到增强骨骼强度的作用，而基础饲粮组及低磷饲粮组相比较植酸酶添加组就明显显现出骨质较为疏松、骨密质也较薄等情况，这与前面骨骼中灰分率及骨骼钙、磷含量的变化一致。

3.4 新型耐热植酸酶对断奶仔猪养分表观消化率的影响

大量的研究已证实，植酸酶能作用于植酸磷及植酸盐，释放被螯合的蛋白质、淀粉、钙、磷及一些消化酶，进而提高机体对这些物质的消化能力，从而提高这些物质的表观消化率和生物学效价［19－20］。从本试验结果来看，植酸酶添加组在养分表观消化率上基本达到甚至超过无机磷添加组，基本好于低磷饲粮组，与预期结果一致，也与许多关于植酸酶的研究［21－23］结果相似。但有试验研究发现，植酸酶添加组的养分表观消化率要好于甚至显著高于无机磷添加组［24］。高俊杰等［25］的研究发现，饲粮中添加植酸酶不影响断奶仔猪的粗蛋白质表观消化率。出现这种试验结果可能的原因是对照组添加有无机磷，改变了饲粮中的钙磷比值，使其比值达到了适合畜禽生长的1.2 ∶1［26］，促进了断奶仔猪机体内的钙磷平衡，促进断奶仔猪的生长，而低磷饲粮组由于饲粮中磷的缺乏，加之植酸的作用，使仔猪体内的钙、磷比例失衡，不能有效合成为仔猪供能的三磷酸腺苷，进而导致机体各项机能受阻，也影响仔猪体内一些有效物质的生物活性，最终导致其表观消化率低于其他组。

4 结论

① 低磷饲粮中添加500、1 000 U/kg新型耐热植酸酶在一定程度上促进了断奶仔猪对骨骼中钙、磷的沉积，并有效提高了断奶仔猪养分的表观消化率，但对血液中钙、磷代谢影响不大。

② 仔猪饲粮中添加500、1 000 U/kg新型耐热植酸酶能替代部分无机磷，起到与基础饲粮相同甚至更好的作用，其中1 000 U/kg添加量稍好，但与500 U/kg添加量差别不大。

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