适用于转录组测序的大白菜小孢子总RNA提取方法筛选

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（1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193）

适用于转录组测序的大白菜小孢子总RNA提取方法筛选

林 燕1，2李 菲1张淑江1张 慧1章时藩1孙日飞1*张振贤2

（1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193）

为了找到适用于转录组测序要求的大白菜小孢子总RNA提取方法，以出胚率较高的吉红82为试材，以热激诱导处理后的小孢子为研究对象，比较分析了TRIzol法、改良CTAB法及超纯试剂盒法3种方法的RNA提取效果。结果表明：TRIzol法（磨样）和改良CTAB法提取的RNA浓度较高，但完整性较差；超纯RNA提取试剂盒法提取的RNA质量最高，且完整性好，能够满足转录组测序的要求。

大白菜；小孢子；RNA提取；转录组测序

自Nitsch和Norreel（1973）首先成功应用游离小孢子培养技术获得烟草小孢子胚和再生植株之后，植物游离小孢子培养技术开始成为培育纯合双单倍体（double haploid，DH）的重要技术手段。目前已在甘蓝型油菜（Zaki & Dickinson，1995；Zhao et al.，1996）、大白菜（栗根义 等，1993；姜立荣等，1996）、小麦（Reynold，1993；Kunz et al.，2000）、玉米（Pescitelli et al.，1990；Massonneau et al.，2005）等作物上进行了许多游离小孢子胚胎发生机制的研究，并利用生物技术手段鉴定出一些经热激诱导后在小孢子胚胎发生中特异表达的基因和蛋白质。但至今为止只有从甘蓝型油菜中提取出来的BBM基因被公认为具有胚胎发生能力（Pechan et al.，1991；Boutilier et al.，2002）。一些在胚胎发生过程中特异表达的基因是否起作用，其作用机理又是什么仍有待验证。在小孢子胚胎发生这一特殊的发育过程中还存在着许多目前研究中没有关注到或没有被挖掘到的重要作用基因和信号调控途径，进一步加大游离小孢子胚胎发生机理的研究力度，尽快找到胚胎发生过程中的重要功能基因并弄清其调控表达途径势在必行。

前人利用mRNA差异显示技术（mRNA differential display reverse transcription PCR，DDRTPCR）（Liang & Pardee，1992）、抑制消减杂交技术（suppression substractive hybridization，SSH）（Diatchenko et al.，1996）、基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）（Velculescu et al.，1995）和基因芯片技术（gene chip）等对小孢子胚胎发生过程中的基因差异表达情况进行了研究，也取得了一定的进展。高通量测序平台的转录组测序技术（RNA-seq）能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，具有定量更准确、可重复性更高、检测范围更广、分析更可靠等优点；同时，该技术还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP，提供最全面的转录组信息（Alagna et al.，2009；McCarthy et al.，2012；Dobin et al.，2013）。目前，转录组测序技术已被越来越多的应用到基因转录水平的研究中，成为基因差异表达研究最为高效、准确的手段之一，并大有替代之前应用范围较广的mRNA差异显示技术、抑制消减杂交技术、基因表达系列分析技术和基因芯片技术等的趋势。因此，应用转录组测序技术开展小孢子胚胎发生的相关研究是了解胚胎发生相关基因的表达模式、弄清胚胎发生机制的有效手段。

转录组测序技术对RNA质量要求较高：植物样本RNA浓度≥400 ng·μL-1，总量＞20 μg，OD260/OD280为1.8～2.2，OD260/OD230＞1.8，28 S/ 18 S≥1.5，RIN≥6.5。小孢子在早期发育的细胞形态阶段进行RNA提取相对于普通植物组织来说有一定的难度，并且在实际研究过程中一次能够收集到的样品量也不多。而转录组测序技术较目前常用的抑制消减杂交、基因芯片等差异基因研究手段，以及定量表达等表达模式研究手段（Maraschin et al.，2005；Tsuwamoto et al.，2007；Sánchez-Díaz et al.，2013；Żur et al.，2014）来说对RNA的质量要求更高。因此找到适用于少量小孢子样品的高质量RNA提取方法是转录组测序及相关分子生物学研究的基础。本试验以出胚率较高的大白菜吉红82为试材，以热激诱导处理后的小孢子为研究对象，比较分析了TRIzol法、改良CTAB法和超纯RNA提取试剂盒法3种方法提取的RNA的质量，以期找到能够满足转录组测序要求的RNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以易出胚的大白菜吉红82（中国农业科学院蔬菜花卉研究所白菜育种课题组提供）为试材，2012年12月上旬育苗，2013年1月中旬定植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所日光温室，3月中旬至5月中旬取花蕾进行小孢子培养。

TRIzol购自Invitrogen公司，超纯RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司（CWbio. Co.，Ltd.，Cat#CW0588）；氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 游离小孢子培养 取健壮、无病害花蕾，镜检后挑选小孢子处于单核靠边期（培养的最佳时期）的花蕾，先用70%酒精消毒30 s，再用7%饱和次氯酸钠溶液表面消毒15 min，无菌水冲洗3次后放于研钵中，加少量B5-13洗涤培养基，用研锤轻轻挤压使小孢子游离于溶液中，用孔径为300目的尼龙网纱过滤，收集滤液，1 200 r·min-1离心3次，每次4 min，离心后弃上清液，将收集到的小孢子悬浮于过滤灭菌的NLN-13基本培养基，调整孢子浓度为1×105个·mL-1，分装于60 mm×15 mm培养皿，每皿2～3 mL，用石蜡膜封口，33 ℃热激诱导24 h。

1.2.2 RNA提取 收集33 ℃热激诱导处理24 h后的小孢子，1 200 r·min-1离心3次，每次4 min，离心后弃上清液，留下的沉淀立即进行RNA提取或在液氮中冻透后存于-70 ℃冰箱备用。试验中使用的量筒、试剂瓶等玻璃制品以及研钵、药勺、移液枪头、离心管等均用0.1% DEPC处理；双蒸水经0.1% DEPC处理过夜后再高压灭菌（121 ℃，30 min），其他化学试剂均用DEPC处理水配置；电泳槽及电泳托、梳子等凝胶电泳用品用3%双氧水浸泡数小时后用再蒸馏水冲洗。

采用3种方法进行RNA提取。A，TRIzol法，匀浆化处理又分为2种：A1，收集小孢子细胞5×106～10×106个，直接加入1 mL TRIzol试剂，反复吸打几次混匀；A2，收集等量（小孢子细胞5×106～10×106个）样品，置于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨（先用研锤将冷冻住的样品小心地用力碾压几次，待样品呈小颗粒状时再由慢及快进行研磨），待液氮挥发后立即将充分研磨的粉末状样品移入1.5 mL的EP管中，加入1 mL TRIzol试剂，在旋涡振荡器上充分混匀。其余步骤严格按照说明书操作，提取的RNA立即进行检测或在液氮中冻透后存于-70 ℃冰箱备用。B，改良CTAB法，参照黄雪梅等（2009）的方法稍加改动。C，超纯RNA提取试剂盒法，严格按照说明书的提取步骤进行操作。

1.2.3 RNA质量检测 采用Nanodrop 2000检测总RNA浓度及OD值，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带的清晰度和完整性；采用Agilent 2100检测28 S/18 S值及RIN值。

2 结果与分析

2.1 RNA电泳结果分析

由图1可以看出，3种方法提取的RNA都能看到28 S和18 S两条带，但是用TRIzol法直接进行细胞裂解（A1）提取的RNA条带不明亮，而且发生严重的拖尾和弥散现象，说明该方法提取的RNA浓度较低，完整性较差；用TRIzol法磨样（A2）后提取的RNA条带较清晰，28 S的亮度比18 S高，明显好于A1，但有轻微的拖尾现象；改良CTAB法（B）提取的RNA条带清晰，但存在明显的拖尾现象；超纯RNA试剂盒法（C）提取的RNA条带无拖尾、弥散现象，28 S和18 S两条带明亮且亮度比约为2∶1，说明其完整性好。

图1 不同方法提取的RNA电泳检测结果

2.2 RNA质量及浓度分析

从表1可以看出，3种方法提取的RNA的OD260/OD230和OD260/OD280值都符合标准，说明纯度较好，没有污染。用TRIzol法直接进行细胞裂解（A1）提取的RNA浓度较低，RIN值为2.97，说明RNA降解严重，完整性差；用TRIzol法磨样（A2）后提取的RNA浓度较高，28 S/18 S＞1.5，但是RIN值为5.53，略低于转录组测序要求；改良CTAB法（B）提取的RNA浓度和总量均能达到要求，但28 S/18 S值为1.10，RIN值也偏低；超纯RNA提取试剂盒法（C）提取的RNA质量最高，总量远超过20 μg，RIN值达到6.90，能够满足文库构建和转录组测序的要求。

表1 不同方法提取的RNA质量

3 结论与讨论

RNA提取是分子生物学研究的技术基础，不同植物由于其生理特性不同，适宜的RNA提取方法亦不同，即使同种植物的不同组织适宜的提取方法也不尽相同（李宏和王新力，1999；杨占军 等，2009）。植物游离小孢子为液体培养基悬浮培养，相对于普通植物组织来说RNA提取有一定难度，而且在实际研究过程中每个处理能够收集到的样品量也不多，样品中残留的水分还会对液氮研磨产生一定影响。本试验中，每个处理收集小孢子数为5×106～10×106个，置于预冷的研钵中，加入液氮后会冻住，因此应先用研锤将冷冻的样品小心地用力碾压几次，待样品呈小颗粒状时再由慢及快研磨成粉末状，以防因研磨力度过大导致样品溅出而造成浪费，影响RNA提取效果。

转录组测序等分子生物学研究技术对RNA的质量和浓度要求较高，因此急需找到一种适合游离小孢子RNA提取的方法以满足相关研究工作的要求。TRIzol的主要成分是酚，主要作用是裂解细胞，可以在破坏细胞使RNA释放出来的同时保护RNA的完整性；同时，TRIzol里加入了可以抑制RNA酶的胍盐。在核酸物质得到释放的同时，细胞中的蛋白也被释放出来，而氯仿可以使蛋白变性，降低蛋白的溶解度，同时还可以去除植物色素和蔗糖。加入氯仿后离心，RNA存在于上层水样层中，收集上层水样层后采用异丙醇沉淀来还原RNA。由于异丙醇主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5 S RNA、tRNA及多糖不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性3条带中5 S RNA带很不清楚。最后加入乙醇的主要作用是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，而痕量乙醇很容易挥发掉。本试验中，按普通植物组织提取法先进行液氮研磨再匀浆处理，得到的RNA浓度、纯度和完整性都比较好，可以用于RT-PCR、southern等相关研究，但是RNA的完整性还达不到转录组测序的要求。而TRIzol法中针对悬浮细胞裂解提取RNA的方法目前主要应用于动物细胞和细菌，并不适合植物小孢子细胞，这可能是因为植物细胞壁影响了裂解效果造成的。

改良CTAB提取液中高浓度的NaCl以及CTAB和β-巯基乙醇共同作用都可以去除多糖等代谢杂质，因此其最突出的作用特点是能够有效去除多酚、多糖等次生代谢物（胡根海和喻树迅，2007；王春晖 等，2013）。小孢子培养过程中会产生一部分次生代谢产物，而且培养基中含有大量糖分，因此改良CTAB法可能对消除这些成分的影响起到一定的作用。另外，CTAB通对植物细胞的裂解去污作用以及与β-巯基乙醇共同对蛋白的强烈变性作用，可以使核酸彻底被释放出来。该方法操作简单且费用较低，但准备提取液等试剂比较繁琐，RNA提取所需要的时间也比较长。

本试验中选用的试剂盒具有独特的Shredder分离柱，能有效过滤高粘度的植物裂解物，同时采用硅胶吸附柱对RNA进行纯化，多聚糖等污染物可被有效去除，提取的RNA纯度高；利用无RNase的DNase在柱上进行消化去除后无DNA残留；Buffer中加入β-巯基乙醇还可以使蛋白强烈变性，避免污染。因此，使用该试剂盒提取的RNA浓度和纯度均较高。另外，超纯试剂盒法通过过柱离心的方法分离细胞碎片以及去除杂质，不需要多次有机溶剂溶液抽提，简单快捷；加上所有Buffer都是小量包装，这些都在一定程度上降低了污染。此方法也不需要低温环境，比较方便。

本试验对3种RNA提取方法进行了比较，发现TRIzol法直接裂解细胞进行RNA提取效果比较差，不适用于大白菜小孢子RNA提取。超纯RNA提取试剂盒法提取的RNA质量高、完整性好，能够满足转录组测序的要求。但是本试验所选取的方法有限，而且RNA提取受环境和操作等因素的影响也比较大，有必要对更多的RNA提取方法进行筛选，在实际操作中对环境和操作因素也应格外注意，以期找到更加高效、便捷且费用较低的RNA提取方法，为转录组测序等技术的应用奠定坚实的基础。

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Screening of Methods to Extract Total RNA from Micro-spore of Chinese Cabbage Suitable for Transcriptome Sequencing

LIN Yan1，2，LI Fei1，ZHANG Shu-jiang1，ZHANG Hui1，ZHANG Shi-fan1，SUN Ri-fei1*，ZHANG Zhen-xian2

（1Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In order to find out micro-spore extracting method suitable for transcriptome sequencing，this study took Chinese cabbage‘Jihong 82’as experimental material and micro-spore induced with heat shock as research object．This study compared and analyzed the RNA extraction effects by 3 different methods：TRIzol method，improved CTAB method and ultrapure kit method．The results showed that RNA concentrations extracted by TRIzol method and improved CTAB method were higher，but the RNA integrity was lower．Quality of RNA extracted by ultrapure kit method was the highest，and the RNA inegrity was also good．Therefore，RNA obtained by this method was suitable for satisfying the requirement of transcriptome sequencing．

Chinese cabbage；Micro-spore；RNA extraction；Transcriptome sequencing

林燕，女，博士研究生，专业方向：大白菜遗传育种，E-mail：sdau_yan@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：孙日飞，男，研究员，博士生导师，专业方向：大白菜遗传育种，E-mail：sunrifei@caas.cn

2014-03-21；接受日期：2014-05-16