高效液相色谱法手性固定相拆分手性药物研究进展

李雪，李优鑫，张勇

(天津市现代药物传递及功能高效化重点实验室天津大学药物科学与技术学院，天津 300072)

手性，指化合物具有结构上镜像对称而又不能完全重合的分子，作为自然界生命基础的生物大分子都具有手性，人们所使用的药物绝大多数也具有手性。手性分子两对映体具有完全相同的物理、化学性质，但具有不同的药理活性，手性药物进入人体往往一种对映体有效而另一种无效甚至具有毒性。20世纪60年代，一种称为反应停的孕妇使用的镇定剂，上市后导致1.2万名婴儿的生理缺陷，因为反应停的右旋体为止吐药，而左旋体具有强烈的致畸作用。服用单一对映体的手性药物，不仅可以避免对于毒性对映体的摄入，减轻人体对于无效对映体的代谢负担，还可以提高药物专一性、减少服药剂量。因此，手性药物的分析分离在生物、医药领域一直是研究的热点。

HPLC作为经典实用的分析方法，被广泛应用于手性药物的拆分。HPLC分离手性药物对映体分为间接法和直接法，间接法又称为手性试剂衍生化法，直接法分为手性流动相添加剂法和CSP法。CSP作为HPLC分离手性药物中最有效的一种方法，其发展一直是HPLC分离手性药物的重点，目前用于手性分离的固定相已经有接近100种［1］。根据手性固定相的不同来源，可分为天然、半合成和全合成三大类。本文介绍国内外近几年手性固定相拆分手性药物的研究进展，包括几种经典类型及一些新型手性固定相。

1 几种经典手性固定相的手性药物拆分

1.1 环糊精类手性固定相

环糊精(CD)手性固定相分为化学键合固定相及物理涂覆固定相。化学键合固定相是将CD或其衍生物通过共价键键合至硅球表面，这类固定相具有耐溶剂且高柱效等优点。环糊精物理涂覆是利用硅胶吸附特性，将CD或其衍生物直接涂覆至裸露的硅球表面，是一种较为简单且有效的固定相制作方法［2］，但由于这种方法多用于正相高效液相色谱，因此这方面的研究工作较少，这里主要介绍化学键合手性固定相。

Nikolic等［3］使用中性β-CD化学键合固定相对药物有效成分S-氯吡格雷和会引起不良反应的R-氯吡格雷实现良好分离，并进行了方法学验证。由于天然CD的手性识别能力有限，无法满足大量不同结构手性药物的分离，因此多种多样的衍生化CD被应用于手性分离。沈静茹等［4］以双［-6-氧-(-3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4 单酯)-4-］-β-CD 键合全多孔硅胶基质为高效液相色谱固定相，以正相和反相模式对药物扑尔敏进行了手性分离。Rao等［5］使用高效液相色谱反相模式及二甲基-β-CD键合固定相对舍曲林手性对映体及5种相关手性物质进行了分离及方法学验证，此方法足以对舍曲林进行质量控制和纯度检测。目前研究较多的还有帽形(capped)CD，其中CD和其他主体超分子化合物(如冠醚、杯芳烃等)偶联起来，形成一种具有多重识别位点的主体化合物，其中两种主体超分子的协同效应增加了对客体分子的识别，表现出优秀的手性识别能力和分离选择性。Zhao等［6］合成利福霉素帽形-(3-(2-O-β-环糊精)-2-羟基丙氧基)-丙基甲键合手性固定相(RCD-HPS)，其具有两个手性结合位点:利福霉素和β-CD，对于华法林等几种芳香位置异构体的手性药物显示出良好的分离能力。

1.2 多糖类手性固定相

多糖类手性固定相是将多糖键合至硅胶上，通过在羟基上连接各种不同取代基团，得到具有不同手性识别能力的HPLC固定相。多糖含有众多的可能作用位点，其手性识别能力被归因到具有手性的碳水化合物单体及其螺旋形二级结构。

目前，多糖类手性固定相是HPLC手性分离中应用最为广泛的一类固定相［7］。Peng等［8］在反相HPLC模式下，利用200余种外消旋体手性药物，检测了20多种多糖衍生化手性固定相的分离能力。Antonina等［9］利用多糖手性固定相分离了特康唑、联苯苄唑等10种抗真菌手性药物对映体，并根据改变键合有不同类型多糖的HPLC色谱柱、色谱分离温度、药物主要成分、流动相添加剂等条件，观察出手性对映体经分离洗脱顺序的逆转。Mohamed等［10］使用纤维素手性柱对血浆及药物制剂中的克仑特罗进行了分离及鉴定，通过方法学验证证实该HPLC方法对该药物具有高度专一性，可以用于药物质量控制及治疗药物监测。Kazoka等［11］对两种吡拉西坦衍生物使用6种多糖手性固定相进行了分离，并寻找出了手性识别能力较高的多糖固定相。通常，在HPLC分离手性药物时，在流动相中加入少量的添加剂，可以改变分离效果。Mosiashvili等［12］系统研究了在极性有机流动相、多糖类手性柱作为固定相时，添加酸性或碱性添加剂对几种碱性药物手性分离的影响。

1.3 Pirkle型手性固定相

Pirkle型手性固定相是将单分子层的手性有机分子通过适宜的连接基团键合到硅胶载体上制得的，因而被称之为“刷型”或“束型”。由于良好的载样能力，Pirkle型固定相非常适用于临床前少量药物的HPLC手性分离制备［13］。

过去几年，Pirkle型Whelk-O 1手性固定相在药物开发早期解决手性分离工作，在所有商业可得的Pirkle手性柱中，研究显示只有Whelk-O 1型对特殊的活性药物显示出了手性异构体分离能力。Thomas等［14］发明了柱耦合方法，提高了Whelk-O 1手性柱的分离效率及应用范围。William等［15］使用4种Pirkle型手性固定相分离一种新型的苯吗喃类药物，结果显示，仅有Whelk-O 1手性固定相能够达到较好分离效果。Karol等［16］使用点击化学的方法合成Pirkle-阴离子交换混合型手性固定相，在正相、反相等液相色谱条件下，均基线分离了洛芬类药物。

1.4 蛋白质类手性固定相

蛋白质是由氨基酸为单位组成的具有复杂三维结构的生物大分子，所有蛋白质都具有识别手性分子的潜力。蛋白质类手性固定相的优点是在反相液相色谱法中可以用水作为流动相，虽然具有良好的手性选择能力，但较差的稳定性和较小的载样量限制了此类固定相的应用。

牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、α-酸性糖蛋白(AGP)是主要用于手性分离的蛋白质，它们通过多种方法被固定在二氧化硅基质上，制成HPLC固定相。Stewart等将BSA固定在琼脂糖基质上，作为手性固定相进行液相分离［17］。Mallik 等［18］通过巯基将蛋白质及其他配体固定化在二氧化硅填料上制成固定相，其中HAS作为被键合的模型蛋白在HPLC中显示出高亲和力，对手性药物华法林和布洛芬实现了良好分离。由于青霉胺紫外吸收强度较弱，Bhushan等［19］以茚三酮作为可逆的标记试剂，利用AGP手性固定相进行分离，优化出了最佳分离条件(分离度超过2)并进行了制备。Akapo等［20］使用AGP手性固定相对福莫特罗的4种立体异构体进行了HPLC分析方法的建立和验证。

2 新型手性固定相

虽然目前广泛应用的几种经典手性固定相可以满足大部分的分离需求，但一些特定结构类型的例如立体中心是非极性［21］的分析物还需要更多新型手性固定相的设计。目前已经用于手性分离的新型手性固定相有环果聚糖类手性固定相、金属复合物键合手性固定相、含硼手性固定相、离子性液体手性固定相等。环果聚糖类手性固定相在2009年第1次被Armstrong等报道使用［22］，其通过每单位呋喃果糖含有的4个手性中心与分析物之间的作用［23］识别手性分子。Perera等［24］利用衍生化环糊精及环果聚糖类手性固定相对17种四氢苯并咪唑衍生物外消旋体实现良好分离。第1个在室温下融化为液体的有机盐为乙硝酸铵，与将离子性液体作为流动相添加剂来提高HPLC分离度相比，将离子性液体通过共价键合到CSP上的文献报道较少［25］，而Zhou等开发出一种将离子性液体键合至硅胶上功能化的β-CD手性固定相，分离了16种手性芳香醇衍生物及两种外消旋体药物。医药、生物等领域分析样品种类增多的同时，对手性固定相种类的需求逐渐增大，但要将这些新型手性固定相广泛应用于手性药物的拆分还有一定的距离。

3 结束语

总之，固定相与手性药物对映体发生手性识别作用，则一定有三点相互作用。随着计算机化学的不断发展，与传统方法相比，CSP的设计达到了更高水平。组合方法与高通量合筛选已用于研制高选择性的具有手性识别能力的固定相。数据库结合扩展的自动筛选方法学，再配合多通道微流控HPLC，将提供一个真正高通量方法，以快速鉴别最有前景的CSP。用CSP法分析分离外消旋手性药物是一种经济而有效的途径，而要得到分离效率高、稳定性好、适用范围广的手性固定相，则需要对手性固定相识别机理更深入的研究及科研人员的不懈努力。

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