乙二胺四乙酸依赖性假性血小板减少症发病机制的研究进展

欧洋华(综述)，江咏梅，张 鸽(审校)

抗凝剂乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)盐能与血液中钙离子结合成螯合物，使Ca2+失去凝血作用，而阻止血液凝固。由于其对血细胞形态、血小板计数影响很小，适用于血液学检查，尤其是血小板计数。1993年国际血液学标准化委员会将其推荐为血液常规分析的抗凝剂[1]，伴随着全自动血细胞分析仪的普及使用，EDTA在世界已广泛应用于血细胞的分析检测。所谓EDTA依赖性假性血小板减少症(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia,EDTA-PTCP)就是由于使用EDTA来抗凝全血后，并用血液分析仪检测血小板数量而出现其假性减少的现象，占假性血小板减少的90%以上，容易导致误诊、误治，近年来国内外关于EDTA-PTCP报道增多，已引起广泛关注。现就其发生原因和机制的国内外研究进展综述如下。

1 EDTA-PTCP导致血小板下降的原因

1.1EDTA诱导发生血小板聚集 EDTA盐可以诱发血小板黏附和聚集，导致血小板假性减少[2],这种现象主要是由于EDTA作为试管标本中的抗凝剂在体外导致的，并且是由于在EDTA存在的情况下血小板抗体引起的血小板聚集所致，导致了全自动血细胞分析仪无法正确辨识血小板，而基于检测原理以及通道的不同把聚集的血小板误计为白细胞、红细胞或巨大的血小板致使其计数下降,造成检测中出现血小板假性减少,而白细胞或红细胞计数异常。这种体外血小板的凝集呈非稳固性，是一种非机体凝血机制障碍，无出血临床表现[3]。

1.1.1EDTA诱导血小板聚集被误认为白细胞 EDTA盐有时诱发的血小板黏附和聚集，其大小与白细胞相似，因为血细胞计数仪很难分类鉴别而常把前者误计为白细胞,导致白细胞计数假性增高而血小板计数假性减少。李荣辉等[4]在观察EDTA-PTCP的白细胞直方图时发现，在中小细胞群(淋巴细胞群)前面出现异常小峰，小细胞群基底抬高，其他指标正常；随着EDTA抗凝时间增加，血小板数量逐渐减少，白细胞数量逐渐增加。马春芳等[5]观察到27例确诊的EDTA-PTCP均有非白细胞域散点图的特殊改变。黄丽君等[6]观察到血细胞分析仪和血涂片中的凝集块大小各异，常由3～5个血小板凝集在一起，最常见是几十、上百个凝集在一起，而血细胞分析仪中血小板凝块能抵抗溶血素作用，因此被当作白细胞进行计数导致白细胞计数假性增高，血小板计数假性减少。

1.1.2EDTA诱导血小板聚集被误认为红细胞或巨大血小板 在某种特定的条件下，EDTA抗凝血中形成了与红细胞大小相似的血小板聚集团块[7]，导致血细胞分析仪不能识别为血小板而使血小板计数假性减少。郭珊等[8]观察了电阻抗法血细胞分析仪血小板计数错误20例并分析其原因，认为由于电阻抗法血细胞分析仪不能完全将血小板与其他类似大小的物质，如红细胞或白细胞碎片、灰尘等区分开，致使血小板计数误差大，采用EDTA抗凝时，如采血后搁置，血小板会形成凝块，聚集的血小板体积增大，会被当做一个大血小板计数或者被误计数为小红细胞，使得血小板计数明显减少。

1.2EDTA诱导血小板发生卫星现象 血小板卫星现象偶见于EDTA抗凝血中，发生率约为1.2万分之一[9]。所谓血小板卫星现象，是血小板黏附、围绕在中性粒细胞周围(或者偶尔黏附于单核细胞)而呈现似卫星状分布的现象，有时可见血小板吞噬现象，而此时的血小板和中性粒细胞形态和功能均正常。当血小板卫星现象发生时，血细胞分析仪把血小板错误地当作白细胞进行计数，导致白细胞计数假性增高，血小板计数假性减少，此时血小板计数可有中度减少[10]，其发生机制和临床意义尚不清楚。

2 EDTA-PTCP发生的有关因素

2.1与EDTA抗凝时间、温度的关系 EDTA诱导血小板聚集与抗凝时间有关,呈时间依赖性，即抗凝时间越长，血小板聚集现象越严重，血小板数量越低[3,11]。郭利利等[1]对EDTA-PTCP的动态观察发现，采血后立即检测血小板，尚未发生聚集，而在15 min后，随时间延长聚集越明显。张静等[12]动态观察发现，EDTA抗凝管即刻测血小板正常，在30 min时已显著降低，随着时间的延长，血小板降低越显著。EDTA诱导血小板聚集与温度有关，其发生受低温环境的影响[2]，在室温条件下出现血小板聚集现象，而在37 ℃时则无此现象的发生[12]，推测此现象可能为一种温度依赖性抗体所导致。

2.2与患者疾病和治疗措施的关系 目前，关于EDTA-PTCP与基础疾病和治疗措施是否有关尚无明确结论。张辉等[13]认为,EDTA-PTCP的发生与特殊药物的作用无关。也有文献报道，其发生与临床治疗用药情况有关，如某些抗生素、中成药物制剂、奥氮平、放(化)疗等可诱导EDTA-PTCP的发生[14-15]，且住院患者的发生率高于门诊及急诊患者的发生率[16]，多数情况下EDTA-PTCP伴发于某种严重疾病[11,15]，并发现伴发急性肝炎、急性髓性白血病、败血症和巨细胞病毒感染等疾病治疗后，EDTA依赖性血小板凝集现象消失，提示假性血小板减少现象与住院治疗和患者疾病的严重性有关，EDTA-PTCP可能是后天获得的[11]。

3 EDTA-PTCP发生的机制

3.1EDTA-PTCP是一种自身免疫性疾病 EDTA-PTCP的发病机制比较复杂，目前尚不十分清楚。有的学者认为可能与患者基因、染色体异常等遗传因素有关[16]，有的学者认为可能与自身免疫或者临床肿瘤病理有关[17]。多数学者认为,EDTA-PTCP是一种自身免疫性疾病,其发生可能与血浆中的抗血小板抗体和抗心磷脂抗体等自身抗体，以及与血小板表面存在的某种隐匿性抗原有关。

有报道认为，EDTA-PTCP之所以是一种自身免疫性疾病，其主要依据是这类人群中的血清免疫球蛋白(Ig)有较大比例升高，且抗血小板自身抗体和抗心磷脂抗体呈阳性，将这类患者的血浆与健康人血小板一起孵育能引起健康人的血小板聚集，但健康人的血浆却不会引起这类患者的血小板聚集[7]。这些自身抗体与血小板的特异性结合，形成抗原抗体复合物，即循环免疫复合物，改变了血小板的固有形态及结构，使血小板的表面电荷与膜特异性发生变异，在某种特定的条件下与EDTA盐结合而形成类似红细胞、白细胞大小的血小板聚集团块，致使全自动血细胞分析仪不能确认血小板而使血小板计数偏低[18]。郭利利等[1]对EDTA-PTCP进行了动态观察分析，发现在采血后立即检测血小板尚未发生聚集，15 min后随时间延长聚集越明显，而一般的抗原抗体形成免疫复合物是在抗原抗体接触后几分钟内，在30 min左右能形成稳定的免疫复合物。此动态分析支持上述观点。

3.2EDTA-PTCP自身抗体、抗原产生机制 对EDTA-PTCP自身抗体、抗原产生机制的认识尚未取得一致意见，Kunicki等[19]证实了与EDTA-PTCP相关的自身抗体的原型，涉及假性血小板减少的自身抗体是自然出现的具有抗血小板活性的抗体，缺乏病理学意义，并且有可能通过识别老化的或损伤的血小板的隐匿抗原，将它们从血液中清除出去。而许多学者认为是在EDTA盐作为抗凝剂的前提下,出现的免疫介导的冷抗血小板自身抗体[1]。

血小板表面结构主要由细胞外衣和细胞膜组成。前者覆盖在血小板的外表面，主要由糖蛋白的糖链部分组成，是许多血小板受体(如ADP、肾上腺素、胶原、凝血酶等)所在部位；后者由膜蛋白和膜脂质组成，糖蛋白是主要的膜蛋白成分，膜脂质中磷脂是主要成分(75%～80%)。研究发现：EDTA-PTCP患者的血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)表达明显高于正常人[3,20]，在GPⅡb与Ⅲa之间存在有一种单克隆抗体，并且大多数患者有抗血小板抗体时，往往有抗磷脂抗体[16]同时存在，当这些抗体遇到EDTA抗凝剂时，使血小板出现互相凝集[1,21]，提示GPⅡb/Ⅲa、抗血小板抗体和抗磷脂抗体可能与PTCP的起因或机制有关[1,21]。

细胞膜上众多的糖蛋白构成了特殊的血小板抗原系统，EDTA导致血小板聚集的原因，可能是血小板表面存在的某种隐匿性抗原与血浆中可能存在的抗血小板抗体和(或)抗心磷脂抗体等自身抗体相结合所致[4,22]。GPⅡb/Ⅲa主要存在于静息血小板的表面，在血小板变形前隐藏在血小板膜内侧，血小板经活化变形后，GPⅡb/Ⅲa分子的构象发生改变，暴露出纤维蛋白原的受体并与之结合，使血小板发生聚集。血小板凝集由IgG、IgM、IgA引起的比例分别为33%～50%、10%～63%、4%～40%[21,23-25]。在EDTA存在条件下，抗血小板自身抗体引起血小板聚集，这些抗体可能是Ig家族的IgG、IgM或IgA，它们直接针对隐藏的抗原决定簇，这些抗原决定簇平时是在血小板GPⅡb/Ⅲa人凝血因子Ⅸ中隐藏，由于GPⅡb/Ⅲa需要在钙离子存在下保持其异二聚体结构，EDTA可以通过它与钙离子的螯合作用分离GPⅡb/Ⅲa，导致GPⅡb表簇暴露[12]。

药物或外界因素可能导致血小板表面结构发生变化，从而对EDTA的敏感性增加，导致了PTCP的发生[14-15]。孙启鑫等[26]认为，在某些抗肿瘤药物或败血症的激发下，EDTA和血浆中的钙离子螯合，可致血小板GPⅡb/Ⅲa复合物稳定性改变，促使隐蔽抗原暴露，如同时存在自身抗体则发生凝集现象。由于EDTA结合血小板膜上的GP，使血小板膜GP发生变化，从而改变了血小板膜表面某种隐匿性抗原构象，使血小板抗原暴露出来，诱导血小板产生活化，这些活化的血小板与血浆中存在的自身抗体抗血小板抗体结合[ 21，23]，激活血小板细胞膜中的磷脂酶A2和磷脂酶C，致膜脂质中的磷脂水解并释放花生四烯酸、凝血酶原、5-羟色胺、胶原等活性物质，引起血小板纤维蛋白原受体活化，使血小板与纤维蛋白原聚集成团，出现血小板互相凝集[1,15]，导致全自动血细胞分析仪不能确认血小板而使血小板计数偏低。

3.3产生血小板卫星现象的机制 目前尚不清楚，一般认为是因为EDTA和Ig相互作用、非特异性结合血小板之故，被抗体包被的血小板与中性粒细胞结合。有报道指出，血小板卫星现象与冷纤维蛋白原有关，或与血栓收缩蛋白有关，其机制是在EDTA的存在下，血小板膜表面的GPⅡb/Ⅲa以及IgG抗体直接与隐蔽抗原作用，其中就包括GPⅡb/Ⅲa和来自成熟中性多核细胞的Fc段受体Ⅲ的相互作用[9,27]。EDTA依赖的冷抗血小板自身抗体直接作用于血小板膜GPⅡb/Ⅲa上，EDTA可诱导GPⅡb/Ⅲa与来自中性粒细胞的Fc段受体结合形成卫星现象[25]，与血小板结合的自身抗体Fc端还可与单核细胞或淋巴细胞上Fc受体结合，出现卫星聚集现象[18]。

4 结 语

EDTA-PTCP发生的原因复杂，但目前大家对其发生的根本原因认识比较一致，是由于EDTA盐应用于血液标本抗凝条件下，某些患者或健康人血液标本中的EDTA盐诱导抗凝血中的血小板发生互相聚集、堆叠或卫星现象，导致全自动血细胞计数仪不能正确辨认血小板，从而产生血小板计数假性减少。尽管大多数文献认为与一些基础疾病和治疗措施有关，EDTA诱导血小板聚集与抗凝时间、温度有关，但目前还不能得出明确结论。EDTA-PTCP发生的机制目前还不是特别清楚，尽管从不同的角度阐述了各自的理论,但均尚不能全部解释其发生机制，如抗血小板抗体产生的关键环节，血小板及其自身抗体在受抗凝剂作用前后的各种变化机制,为何这种凝集只发生在极少数人身上等，这些都还有待进一步研究。

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