针刺和中药配合应用对大鼠慢性阻塞性肺疾病的疗效研究

张凯彦，姜晓文，周校国，于文会

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmo⁃nary disease，COPD)是多种致病因素引起的小气道非特异性炎症反应和阻塞性通气障碍。COPD气道壁和肺实质慢性炎症及气道结构改变，导致气道管腔狭窄和气流阻力增加，这一过程被称为气道重塑，气道重塑可引起细胞外基质(ECM)代谢紊乱，导致结缔组织的重构，是慢性炎症过程。IL-8和TNF-α炎性介质，可破坏肺的结构，或促进嗜中性粒细胞炎性反应。IFN-γ可通过刺激巨噬细胞、激活嗜中性粒细胞、血管内皮细胞及增强TNF-α对血管内皮细胞功能以及使蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡，从而在COPD气道炎症中起作用。TNF-α能促进嗜中性粒细胞脱颗粒并增强其细胞内外蛋白分解作用，而蛋白分解作用的增强被认为是慢性阻塞性肺疾病形成机制之一，因此TNF-α升高促进COPD的发展[6]。另外，氧化与抗氧化失衡也是COPD发病的重要原因。有文献报道，白芍提取物和麦冬黄酮提取物有清除体内自由基作用[1-2]；平贝母多糖对体内自由基有选择性清除作用[3]；生地黄提取物有一定的抗氧化作用[4]。

本试验利用止咳平喘方（生地黄10 g，贝母10 g，麦冬10 g，芦根10 g，白芍10 g，百部10 g，川芎10 g，当归10 g，山药10 g，五味子10 g，甘草10 g）；煎煮成含量为0.5 g/mL水煎液。与针刺治疗COPD模型大鼠，通过临床观察和检测其血清中HA，LN变化、肺组织中TNF-α、IFN-γ、IL-8、GSH、LPO、MDA变化，为动物慢性阻塞性肺疾病治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂 血清中透明质酸（HA），层黏连蛋白（LN）含量的测定：用ELISA试剂盒（购自R&D sys⁃tems公司）；检测血清中HA，LN含量。脂质过氧化物（LPO）测试盒，丙二醛（MDA）测定试剂盒，谷胱甘肽（GSH）（除蛋白）测定试剂盒，丙二醛（MDA）测定试剂盒。

肺组织检测肿瘤坏死因子α（TNF-α），白细胞介素8(IL-8)，干扰素γ（INF-γ）的测定，用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-8、INF-γ。脂质过氧化物（LPO），谷胱甘肽（GSH），丙二醛（MDA）。

1.1.2 仪器设备 紫外分光光度计，酶标仪，电子显微镜。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组与COPD模型制作 Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重(200±20)g，随机分为4组，即中药治疗组、针刺治疗组、针刺中药治疗组和模型对照组，每组10只。全部大鼠分别于第1、14天气管内注入LPS，剂量为200μg/只。从第2天开始，试验大鼠放在玻璃缸内用烟丝进行烟熏，每次0.5 h，每日上午1次[7]。连续烟熏27 d。

1.2.2 COPD大鼠模型评价 造模结束后，测定大鼠的呼吸频率并观察其临床表现，每组随机抽取1只大鼠，做肺组织形态学观察。

1.2.3 COPD治疗 COPD模型大鼠，对照组灌服生理盐水，剂量为10mL/kg·d，连续4周；针刺治疗组取大鼠的肺腧、关元、合谷、曲池穴位，每次针刺20min/d，同时灌服生理盐水，剂量为10mL/kg·d，连续4周；中药治疗组灌服由生地黄，白芍、甘草、芦根、麦冬、贝母等组成的水煎液，中药浓度为1 mL/kg。剂量为10mL/kg·d，连续4周灌服；针刺中药治疗组在灌服止咳平喘方水煎液10mL/kg·d，同时取肺腧、关元、合谷、曲池针刺，连续4周。在治疗的同时，观察COPD大鼠的临床症状。

1.2.4 采样与指标检测 采样：COPD模型大鼠治疗4周后，每只大鼠双侧眼球采血5 mL，分离血清，并于超低温冰箱冻存。采血后处死大鼠，取2小块肺脏组织，一块置于10%福尔马林溶液中固定，用于做病理切片；另一小块置于冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重后，放入小烧杯内。然后分步先向小烧杯内加冰冷生理盐水，加入的量为组织块重量的9倍。首先用移液管取总量的2/3的生理盐水于烧杯中，剪碎组织后倒入玻璃匀浆管中，再取总量的1/3生理盐水清洗残留在烧杯中的碎组织块，并倒入玻璃匀浆器中进行匀浆，制成10%组织匀浆，2 000 r/min离心，取上清液，超低温冰箱冻存。

血清指标检测：用ELISA试剂盒（购自R&D systems公司），检测血清中HA，LN含量。

肺组织指标检测：用ELISA试剂盒检测肺组织匀浆液中TNF-α、IL-8、INF-γ含量。用紫外分光法测试盒检测肺组织匀浆液中LPO、GSH、MDA含量。

肺组织学检测：H.E.染色光镜下观察肺组织结构，并拍照片。

1.3 数据处理 试验数据用SPSS 17.0统计软件中的ANOVA单因素方差分析和Duncan′s多重比较。

2 试验结果

2.1 COPD大鼠模型评价 大鼠经气管灌注脂多糖溶液后，出现咳嗽症状；烟熏处理1 d，精神倦怠，3 d后，饮食，饮水减少，喜扎堆抱团。模型结束后出现活动减少，蜷缩，神情呆滞，饮水、采食减少，疲软毛枯，呼吸短促，伴有咳嗽，流涕，用听诊器听诊能听到呼吸音，时有喷嚏，体重下降。从肺组织病理学观察，可见轻度间质性肺炎，肺组织局部间质增生。见图1。

图1 COPD大鼠肺组织形态学 （H.E.染色×100）

2.2 治疗效果

2.2.1 临床治疗效果 治疗两周后，针刺治疗组、中药治疗组及针刺中药治疗组精神尚佳，毛发较有光泽，饮食正常，呼吸尚平稳，体重增重明显。

2.2.2 各组COPD大鼠血清中透明质酸（HA）和层黏连蛋白（LN）变化 中药治疗组与针刺中药治疗组同对照组相比，血清中LN含量均极显著降低（P＜0.01）；中药治疗组与针刺中药治疗组与针刺治疗组相比，血清中LN含量降低（差异极显著）。针刺治疗组、中药治疗组、针刺中药治疗组血清中HA含量较对照组降低（差异极显著P＜0.01）；针刺中药治疗组血清中HA含量低于针刺治疗组，差异极显著（P＜0.01）。见表1

表1 各组COPD模型大鼠血清中LN与HA含量变化 (ng/mL，n=9，

表1 各组COPD模型大鼠血清中LN与HA含量变化 (ng/mL，n=9，

▲▲：P＜0.01 vs模型对照组；△△：P＜0.01 vs针刺治疗组

组别 LN HA模型对照组 18.481±2.994 152.884±29.914针刺治疗组 18.859±2.311 114.212±16.649▲▲中药治疗组 6.755±2.417▲▲△△ 101.709±13.7▲▲针刺中药治疗组 7.596±4.522▲▲△△ 90.145±8.784▲▲△△

2.2.3 各组COPD大鼠肺组织GSH、LPO、MDA变化 针刺中药治疗组大鼠肺组织匀浆液中GSH含量较对照组增高，且变化显著（P＜0.05）；中药治疗组肺组织匀浆液中LPO含量下降较针刺治疗组变化显著；针刺治疗组、中药治疗组、针刺中药治疗组肺组织匀浆液中MDA含量均较对照组含量降低，差异极显著（P＜0.01）；中药治疗组、针刺中药治疗组肺组织匀浆液中MDA含量较针刺治疗组含量下降极显著（P＜0.01）。

2.2.4 中药针刺对肺组织匀浆液中细胞因子的影响 中药治疗组肺组织匀浆液中TNF-α含量较对照组下降差异显著（P＜0.05），较针刺治疗组下降极显著（P＜0.01）；针刺中药治疗组肺组织匀浆液较针刺治疗组下降差异显著（P＜0.05）；针刺治疗组、中药治疗组、针刺中药治疗组肺组织匀浆液中INF-γ含量较对照组降低极显著（P＜0.01）；针刺中药治疗组肺组织匀浆液中INF-γ含量较针刺治疗组下降显著（P＜0.05）；中药治疗组、针刺中药治疗组肺组织匀浆液中IL-8含量较对照组、针刺治疗组极显著下降（P＜0.01）见表3。

表2 各组COPD模型大鼠组织匀浆液GSH、LPO、MDA含量变化 (mg/gprot，n=9，

表2 各组COPD模型大鼠组织匀浆液GSH、LPO、MDA含量变化 (mg/gprot，n=9，

▲：P＜0.05 vs模型对照组；▲▲：P＜0.01 vs模型对照组；△：P＜0.05 vs针刺治疗组；△△：P＜0.01 vs针刺治疗组，下表同

组别 GSH LPO MDA模型对照组 786.94±258.51 34.2703±12.9880 9.3933±0.6467针刺治疗组 835.41±129.60 36.0521±10.1008 6.1188±0.3234▲▲中药治疗组 815.82±89.83 21.0271±3.0157▲ 5.2171±0.4037▲▲△△针刺中药治疗组 1015.72±181.85▲ 26.4983±6.8414 4.9170±0.2744▲▲△△

表3 各组COPD模型大鼠肺组织匀浆液中TNF-α、IFN-γ、IL-8含量的测定 （pg/mL，n=9

表3 各组COPD模型大鼠肺组织匀浆液中TNF-α、IFN-γ、IL-8含量的测定 （pg/mL，n=9

组别 TNF-α IFN-γ IL-8模型对照组 219.594±36.570 247.323±33.327 53.558±11.003针刺治疗组 258.855±57.310 116.742±46.406▲▲ 54.574±10.554中药治疗组 110.273±35.963▲△△ 97.195±34.880▲▲ 27.448±13.729▲▲△△针刺中药治疗组 178.426±98.859△ 153.583±44.263▲▲△ 30.315±23.030▲▲△△

2.2.5 中药针刺对肺组织形态学的影响 模型对照组：以肺泡完全闭塞为突出表现，间质增生，伴有炎症，肺泡腔内除有出血外，还有大量嗜中性粒细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，以及脱落的细胞。支气管扩张，细支气管壁增厚，上皮细胞脱落，并含有炎性细胞，有杯状细胞增生(图2，a)。肺血管壁增厚，血管腔内炎性细胞浸润（图2，b）。有大量的成纤维细胞增生（图3，c）。

针刺治疗组：可见局部轻度间质性炎症，间质增生，间质有轻微出血，有少量白细胞浸润，有少量巨噬细胞；支气管壁轻微增厚，少量杯状细胞增生，细支气管中有少量渗出物（图4，d）。间质性肺炎，伴有少量出血（图5）。

中药治疗组：局部肺泡壁出血，间质轻微增生，血管壁周围有炎性浸润，支气管壁轻微增厚，或有少量炎性细胞浸润，其中含有内容物（图6，e）。局部轻微炎症变化，支气管内少量杯状细胞增生，有少量出血，少量脱落的上皮细胞（图7，f）。

针刺中药治疗组：轻度的间质性炎症，血管无明显变化（图8，g）。局部轻微间质性炎症，有少量白细胞浸润。细支气管中有少量内容物，未见有管壁增厚（图9，h）。

图2 模型对照组1（H.E.染色×100）

图3 模型对照组2（H.E.染色×200）

图4 针刺治疗组1（H.E.染色×100）

图5 针刺治疗组2（H.E.染色×100）

图6 中药治疗组1（H.E.染色×100）

图7 中药治疗组2（H.E.染色×100）

图8针刺中药治疗组（H.E.染色×100）

图9 针刺中药治疗组（H.E.染色×100）

3 讨论

3.1 COPD模型制作依据与评价 本试验COPD模型制作方法是采用在密闭箱内点燃烟丝放出的烟雾熏大鼠，使大鼠被动吸烟，同时气管内注入脂多糖溶液，刺激其产生炎症，并有炎性分泌物渗出阻塞气道。造模后大鼠出现咳嗽，活动减少，精神倦怠，饮水、采食量减少，喜扎堆抱团，出现咳嗽症状，流涕，肺听诊有呼吸音，呼吸频率提高。肺组织切片可以观察到，局部间质增生，说明气道重塑产生，这与文献报道相一致[7]。因此，可以认定本试验COPD模型大鼠造模成功。

3.2 不同方法对COPD模型大鼠气道重塑影响

COPD是以慢性气道炎症和气道重建为主要病理特征，病理变化表现为慢性肺部炎症和ECM的代谢紊乱而引起的气道重建。HA是ECM的重要化合物，具有维持水内环境稳定，调节血浆蛋白的分布和基质结构的作用。HA是一组分子量变化很大的糖胺多糖，正常机体内HA由间质细胞合成，经淋巴管入血，大多数最后由肝脏内皮组织摄取并将其分解成乳酸和乙酸；LN是细胞外间质中基底膜的主要成分，本质是一种糖蛋白，它广泛分布于基底膜的透明层，紧贴细胞基底部，与W型胶原结合形成基底膜的骨架囚。HA与LN在血清中的水平反映了COPD模型大鼠肺组织损伤程度[9]。从试验结果看，除针刺治疗组对COPD模型大鼠血清中LN影响无统计学差异外，中药治疗组与针刺中药治疗组均可降低血清中LN与HA水平，差异极显著。而针刺治疗组中HA也降低，差异极显著，中药方与针刺穴位均可影响COPD模型大鼠的气道重塑，从而起到一定的治疗效果。

3.3 不同治疗方法对COPD模型大鼠肺组织抗氧化指标影响 氧化机制在COPD的发生和发展中起着一定作用，正常情况下，肺自身产生氧化物可以自主清除。而患COPD不但氧化物产生增多，而且清除能力下降。许多研究证据表明，在吸烟者和COPD患者中出现明显的氧化应激增强的现象。氧化应激能导致抗蛋白酶的失活，气腔上皮损伤，黏液的过多分泌，移行进入肺部的嗜中性粒细胞增加，促炎介质的基因表达以及各种转录因子的活化。氧化应激反应在机体对烟草烟雾的炎症反应中可能是非常关键的，其参与了机体针对烟草烟雾作用的保护性机制，主要是诱导的抗氧化剂基因的表达。GSH和SOD是重要的氧化物清除剂。COPD患者存在着氧化/抗氧化失衡，提高其抗氧化能力有助于患者的康复[10]。提高机体内源性的抗氧化酶以减少氧化物的产生或增加非酶性抗氧化剂均为有效措施[11]。有人研究麦冬有促进学习记忆和提高氧化酶的表达作用。白芍既能清除超氧阴离子与羟自由基，还能抑制脂质过氧化物.平贝母多糖有抗氧化能力[14-16]。从试验结果可知，针刺与中药方剂止咳平喘方在抗氧化方面都有促进作用，且中药好于针刺治疗效果。

3.4 不同治疗方法对COPD模型大鼠肺组织中细胞因子水平的影响 COPD急性期及稳定期患者肺泡中IFN-γ含量高于正常水平[12]，IL-8是体内重要的内源性趋化因子，在COPD中的主要作用是通过趋化、激活嗜中性粒细胞而实现的。TNF-α的多种前致炎作用可刺激呼吸爆发，TNF-α的刺激其他细胞因子分泌作用可提升炎症级联反应，IL-8与TNF-α在多个环节中的共同作用，使之在肺损伤机制中更为突出[13]。本试验结果显示，中药方剂止咳平喘方可以降低相关细胞因子的含量，以减少炎症趋化，从而抑制炎症反应，来缓解COPD的病情发展。

3.5 不同治疗方法对COPD模型大鼠肺组织形态学的影响 通过针刺及止咳平喘方治疗后的COPD模型大鼠，肺组织形态学方面有一定的改善，主要表现在间质增生、出血及炎症的缓解，炎性细胞浸润的减少，支气管中脱落物的减少，杯状细胞增生的降低。从试验结果可得，止咳平喘方以及针刺在一定程度上可以缓解COPD大鼠肺组织形态学病变，且中药与针刺配合使用效果更好。

4 结论

本试验利用不同方法对COPD模型大鼠进行治疗，通过对各种数据分析，表明中药效果好于单纯针刺处理的COPD大鼠；中药方剂与针刺配合使用可以达到良好的治疗效果。

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